0PN來源胚胎形成的影響因素及其利用價值分析

李澎濤，殷晨星，孟娜娜，王娜，曹娟，張佳妮，王玉真

(保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學科,保定 071000)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)過程中,一般在受精后16～18 h觀察卵母細胞原核情況來判斷其是否受精,具有兩個原核(2PN)的為正常受精卵。大多數未出現原核的卵母細胞為未受精卵,但有時也會存在一些無原核(0PN)的受精卵,其發(fā)生率為11.3%～20%[1],這些受精卵能夠繼續(xù)發(fā)育成卵裂胚甚至囊胚,我們稱這些胚胎為0PN來源胚胎。有一些研究認為0PN受精卵可能為孤雌激活或胚胎染色體異常導致原核不能形成,不建議移植0PN來源胚胎[2-4]。但Manor等[5]認為0PN來源胚胎形成的主要原因是由于觀察受精時間是固定的,而原核出現的時間不確定,導致當那些提早發(fā)育的胚胎原核出現時,未能及時觀察到而錯過。正常受精卵原核一般在受精后23～25 h消失,而對于少部分發(fā)育比較快的受精卵,其原核消失的時間要早于大多數正常受精卵[6-7],而這部分受精卵在定時觀察原核時就可能被判定為0PN。近年來,一些研究表明將0PN來源胚胎移植后也可以妊娠并成功分娩健康嬰兒[8-12]。0PN來源胚胎的利用不僅避免了胚胎的浪費,而且給了患者更多的妊娠機會,尤其對于那些卵巢儲備功能減退的高齡患者尤為重要。Time-lapse時差培養(yǎng)箱在臨床的應用,極大擴展了原核的觀察時間范圍,避免了錯失原核的最佳觀察時間,但由于設備昂貴,限制了其應用范圍。因此對于那些未使用Time-lapse時差培養(yǎng)箱的生殖中心來說,如何安全有效地利用這些0PN來源胚胎具有重要意義。本研究通過對IVF-ET過程中的臨床及實驗室數據進行回顧性分析,探討影響0PN受精卵形成的影響因素、0PN來源胚胎發(fā)育潛能及其利用價值。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2019年1月至2021年12月在保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學科接受IVF-ET及凍融胚胎移植(FET)治療的患者的臨床、實驗室數據及妊娠結局。

納入標準:(1)受精方式為常規(guī)IVF;(2)FET周期均為囊胚移植;(3)雙方均無遺傳性疾病。

排除標準:(1)FET周期排除子宮內膜異位癥患者;(2)FET周期排除內膜轉化日內膜厚度<8 mm者。

本研究共納入符合標準的1 597個常規(guī)IVF周期及596個FET周期。

二、診療回顧

1.控制性促排卵、受精及胚胎培養(yǎng):依據患者年齡、卵巢儲備情況、體質量指數(BMI)等自身情況制定適合患者的促排卵方案,于HCG注射36 h后經陰道超聲引導下取卵。男方患者于女方獲卵后手淫取精,精液液化后均采用密度梯度離心法對精液優(yōu)化處理,所用梯度液為瑞典Vitrolife公司的SpermGradTM,洗精液、受精液、卵裂培養(yǎng)液及囊胚培養(yǎng)液均為瑞典Vitrolife公司的G-seriesTM培養(yǎng)液。于HCG注射39～40 h后在雙井皿中授精,授精濃度10～30萬條/ml,5 h左右去除顆粒細胞,觀察極體情況,有兩個極體(2PB)的卵母細胞判斷為受精卵,對于受精卵比例小于30%的患者進行早補救授精。授精后17～19 h進行原核評價,依據原核數量分為2PN受精卵(正常受精)、0PN受精卵[未觀察到原核,有兩個極體,授精后第2天(D2)發(fā)生卵裂的受精卵]、1PN受精卵(僅觀察到1個原核的受精卵)等。繼續(xù)培養(yǎng)至授精后第3天(D3),依據ASEBIR卵裂期胚胎評價標準[13]對胚胎進行評價,將D3卵裂期胚胎分為Ⅰ～Ⅳ級。將Ⅰ、Ⅱ級正常受精卵裂胚選擇性移植或冷凍后剩余卵裂期胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)至D5/D6,依據Gardner囊胚分級法[14]對形成的囊胚進行評價,選擇3期及以上且滋養(yǎng)層或內細胞團評級不同時為C的囊胚冷凍保存。本中心將所有0PN來源胚胎培養(yǎng)至囊胚階段凍存,在沒有足夠2PN來源的胚胎情況下用于FET。

2.FET周期:囊胚的冷凍和解凍均使用日本Kitazato公司的冷凍及解凍套裝。囊胚冷凍前均進行激光打孔皺縮。按照試劑說明書對胚胎進行冷凍及復蘇,復蘇后將3/4期囊胚進行激光輔助孵化。胚胎復蘇后,在37℃、6%CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)2 h后觀察并記錄解凍胚胎細胞的存活細胞數、壞死細胞數及繼續(xù)培養(yǎng)后的生長情況。復蘇后3～4 h,用移植管連接1 ml氣密注射器,一段式裝管后,B超引導下將胚胎移植入子宮腔中后部。胚胎移植后35 d腹部B超下觀察到宮腔內孕囊及心管搏動為臨床妊娠。妊娠后隨訪,記錄流產、胎停、出生情況等數據。

三、研究分組

常規(guī)IVF-ET周期分為3組:A1組(無0PN受精,731個周期)、A2組(0<0PN受精率≤20%,495個周期)和A3組(0PN受精率>20%,371個周期)。

依據行囊胚培養(yǎng)的D3剩余胚受精來源不同分為2組:B1組(0PN來源胚胎,2 409枚)和B2組(2PN來源胚胎,6 602枚)。

依據FET周期移植囊胚來源分為2組:C1組(0PN來源凍融囊胚,85周期)和C2組(2PN來源凍融囊胚,511周期)。

四、觀察指標及判定標準

患者基線資料,包括年齡、不孕年限、BMI、抗苗勒管激素(AMH)水平、基礎激素水平、促排卵方案及受精相關指標;剩余D3胚的囊胚培養(yǎng)結局,包括囊胚形成率、可冷凍囊胚形成率;FET周期結局,包括移植囊胚數量/質量、妊娠結局及新生兒結局。

0PN來源胚胎形成率=(D1未觀察到原核,有兩個極體,D2發(fā)生卵裂的受精卵數)/獲卵數×100%;囊胚形成率=(D5/D6形成的2期以上囊胚數)/繼續(xù)培養(yǎng)胚胎數×100%;可利用囊胚形成率=(D5/D6形成的可冷凍囊胚數)/繼續(xù)培養(yǎng)胚胎數×100%;臨床妊娠率=(超聲下能檢測到孕囊的妊娠周期數)/移植周期數×100%;種植率=(超聲下檢測到的孕囊數)/移植胚胎數×100%;流產率=(孕周<28周的流產周期數)/臨床妊娠周期數×100%;活產率=活胎分娩周期數/移植周期數×100%;早產率=(孕周<37周的分娩周期數)/分娩周期總數×100%。

五、統(tǒng)計學分析

結 果

一、常規(guī)IVF周期患者臨床資料

1.基線資料:本研究共納入1 597個常規(guī)IVF周期。其中,A1組(無0PN受精)731個周期、A2組(0<0PN受精率≤20%)495個周期、A3組(0PN受精率>20%)371個周期。A2、A3組患者的年齡低于A1組(P<0.05),AMH水平顯著高于A1組(P<0.05),基礎FSH值顯著低于A1組(P<0.05)。 三組間不孕年限、BMI比較無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 常規(guī)IVF周期3組患者基本情況比較(-±s)

2.促排卵資料:A2、A3組患者用藥天數、長方案占比、獲卵數顯著高于A1組(P<0.05);A2組拮抗劑方案占比最低、獲卵數最高,與其余兩組有顯著差異(P<0.05)(表2)。

表2 常規(guī)IVF周期3組患者促排卵治療情況比較[(-±s),%］

二、剩余D3卵裂期胚行囊胚培養(yǎng)情況

常規(guī)IVF周期共授精17 882枚卵母細胞,形成2 422枚0PN受精卵,0PN受精卵形成率為13.54%。D3剩余卵裂期胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至D5/6,其中,B1組(0PN來源D3胚胎)2 409枚,B2組(2PN來源D3胚胎)6 602枚。兩組的囊胚形成率無顯著差異(P>0.05),B1組的可利用囊胚形成率顯著高于B2組(P<0.05)(表3)。

表3 兩組剩余D3卵裂期胚胎進行囊胚培養(yǎng)情況比較(%)

三、FET周期臨床結局

本研究共納入了596個FET周期,其中C1組(移植0PN來源凍融囊胚)85周期,C2組(移植2PN來源凍融囊胚)511周期。兩組患者一般情況年齡、不孕年限、BMI、優(yōu)質囊胚比例、D5囊胚占比比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05);C2組的平均移植胚胎數顯著高于C1組(P<0.05)。囊胚移植后妊娠結局,兩組間胚胎種植率、臨床妊娠率、孕周、多胎分娩率、早產率、新生兒體重、新生兒體長比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05),C1組流產率顯著高于C2組、活產率顯著低于C2組(P<0.05)(表4)。

表4 FET周期兩組患者基本情況及胚胎移植后臨床結局比較[(-±s),%］

討 論

隨著輔助生殖技術的發(fā)展,胚胎體外培養(yǎng)體系在模擬體內生長環(huán)境方面日趨完善,然而與生理狀態(tài)相比,體外培養(yǎng)仍存在一些不盡如人意的地方如延遲細胞分裂、降低胚胎氧化代謝及增加乳酸的產生等。在胚胎的動態(tài)的生長發(fā)育過程中,細胞形態(tài)評價僅能提供有限的參考信息,比如授精后17～19 h對原核數量及形態(tài)的觀察,一些發(fā)育較快的受精卵的原核在此時可能已經消失。Campbell等[15]通過Time-lapse時差培養(yǎng)箱觀察發(fā)現15%～20%受精卵的原核在受精后16 h內就消失了。

本研究通過對IVF-ET周期患者基本情況、臨床治療及實驗室數據的比較,發(fā)現女方患者年齡、AMH水平、基礎FSH水平、獲卵數及促排卵方案的選擇等因素對0PN受精卵的發(fā)生有顯著影響。趙雙丹等[8]對10 834個IVF周期進行了回顧性分析,利用二元Logistic回歸對患者基本情況及獲卵數進行分析,發(fā)現患者年齡、平均周期數、獲卵數多等因素與0PN來源胚胎發(fā)生率具有顯著相關性。在本研究中,與無0PN來源胚胎發(fā)生的患者相比,有0PN來源胚胎的兩組的女方患者年齡小、AMH值高、FSH值低、長方案促排占比高、獲卵數高,且均有顯著性差異,以上參數情況也反映了有0PN來源胚胎的兩組的女方患者卵巢儲備功能要好于無0PN來源胚胎發(fā)生的患者,這一結果與劉景等[16]的報道一致。由于卵巢功能好的患者一般較多的會選擇卵泡期長方案促排卵,這一方案獲卵數顯著高于其他方案[17],并且卵泡發(fā)育不同步明顯,因此獲卵后即使表觀成熟度相同的卵母細胞,實際上其卵母細胞成熟度也并非完全一致[8],每個卵母細胞的受精時間點不同,卵母細胞間的原核呈現時間不同步,這就會導致一些發(fā)育快的合子的原核出現得早于我們的常規(guī)觀察受精時間(16～18 h)[5]。在本研究中為探究0PN來源胚胎率高于正常值的影響因素,將有0PN來源胚胎的患者做了進一步的分組比較,兩組間患者自身因素數據無顯著差異,只有在促排方案選擇及獲卵數上存在顯著差異,0PN來源胚胎率低的組獲卵數顯著高于0PN來源胚胎高的組,從而推測獲卵數及促排卵方案僅影響了0PN來源胚胎的產生,并未對其0PN來源胚胎率的高低造成顯著影響。

本研究中0PN受精卵發(fā)生率13.54%(2 422/17 882)。在1 597個常規(guī)IVF周期中無0PN受精卵周期占45.77%(731/1 597),0PN受精卵率在0%～20%之間的周期占31.00%(495/1 597),0PN受精卵率20%以上的周期占23.23%(371/1 597)。在沒有Time-lapse時差培養(yǎng)箱的情況下0PN受精卵發(fā)生是不可避免的,囊胚培養(yǎng)不僅能形成比卵裂胚更具發(fā)育潛能的囊胚,而且在培養(yǎng)過程中染色體異常、發(fā)育潛能差的胚胎會被淘汰。有文獻報道0PN來源囊胚染色體正常率(60%)顯著高于D3卵裂期胚胎(40%)[18],所以囊胚培養(yǎng)可以對胚胎進行篩選。本中心對于0PN來源胚胎在D3均不選擇移植,而是繼續(xù)培養(yǎng)至D5/D6囊胚階段選擇冷凍保存。有研究發(fā)現利用Time-lapse時差培養(yǎng)箱培養(yǎng),發(fā)育快的胚胎原核消失要早于正常發(fā)育的胚胎,在授精后固定時間16～18 h觀察受精形成的0PN受精卵大多數是由于錯過了這些發(fā)育快的胚胎的原核觀察時間,在隨后的囊胚培養(yǎng)過程中,0PN來源胚胎的囊胚形成率與2PN來源胚胎的囊胚形成率比較無顯著差異[19]。Yao等[18]將1 649枚臨床廢棄胚胎(包括正常及異常受精胚胎)行囊胚培養(yǎng),發(fā)現那些發(fā)育快、在觀察受精時未觀察到原核的0PN來源胚胎的囊胚形成率為16.7%,與2PN來源胚胎的囊胚形成率22.6%相近;而那些在觀察受精時已經卵裂的胚胎的囊胚形成率達63.8%,顯著高于2PN來源胚胎的囊胚形成率。在本研究中0PN來源胚胎的囊胚形成率與2PN來源胚胎的囊胚形成率比較無顯著差異,與以上文獻一致;并且0PN來源胚胎可冷凍囊胚形成率顯著高于2PN來源胚胎(P<0.05),造成這種差異的可能因素為2PN優(yōu)質卵裂胚進行了移植或冷凍,剩下質量較差的胚胎行囊胚培養(yǎng)。這一結果與Fu等[20]報道一致。但也有報道發(fā)現0PN來源胚胎的囊胚形成率(30.03%)顯著低于2PN來源胚胎的囊胚形成率(45.71%)[21]。

人類輔助生殖技術的最終目的是使患者獲得妊娠并成功分娩健康的嬰兒。關于0PN來源胚胎移植是一個備受關注的問題。近年來,一些研究利用囊胚培養(yǎng)技術或Time-lapse時差培養(yǎng)箱對0PN來源胚胎選擇移植并成功分娩健康嬰兒[8-12,16,19]。本研究將0PN來源胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚,冷凍保存,在無2PN來源胚胎可以利用的情況下,對0PN來源囊胚復蘇移植。比較同期0PN、2PN來源囊胚移植后的妊娠結局及新生兒情況,盡管2PN來源囊胚移植的臨床妊娠率、胚胎種植率高于0PN來源囊胚妊娠率、種植率,但無顯著差異(P>0.05),這與劉景等[16]的研究一致。在陳國勇等[22]的研究中,0PN來源囊胚凍融移植的種植率、臨床妊娠率均顯著高于2PN來源囊胚(P<0.05)。馬水英等[9]則認為0PN來源囊胚移植的臨床妊娠率、種植率顯著低于2PN來源囊胚,該研究分別對IVF、ICSI兩種受精方式不同受精來源的囊胚的FET周期妊娠結局進行了對比分析,發(fā)現IVF受精方式無論D5還是D6的2PN來源囊胚的臨床妊娠率、種植率均顯著高于0PN來源囊胚(P<0.05);而ICSI受精方式中相同發(fā)育天數的0PN來源囊胚與2PN來源囊胚的臨床妊娠率、種植率無顯著差異(P>0.05);同樣,在該研究中也報道了IVF受精方式0PN來源囊胚凍融移植的流產率、活產率與2PN來源囊胚相比均有顯著差異(P<0.05)。本研究也有相似結果,0PN來源囊胚對比2PN來源囊胚凍融移植的流產率(40.0% vs. 20.8%)更高、活產率(24.71% vs. 38.75%)更低。

在體外受精-胚胎移植過程中,染色體非整倍體是導致胚胎停育、自發(fā)性流產的主要原因。石小丹等[23]通過植入前遺傳學檢測技術(PGT)對78枚0PN來源囊胚檢測,發(fā)現整倍體率僅為28.21%,顯著低于2PN來源囊胚的46.53%及1PN來源囊胚的63.33%(P<0.05)。在本研究中,0PN來源囊胚與2PN來源囊胚凍融移植后比較妊娠患者的多胎分娩率、孕周、早產率、新生兒畸形率、體重、體長等指標,均無顯著差異(P>0.05),與Chen等[24]研究一致。本研究中2PN來源囊胚移植患者孕周較低、早產率較高的主要因素是2PN來源囊胚移植患者多胎分娩率高于0PN來源囊胚(20.71% vs. 9.52%),2PN來源囊胚移植46例早產患者中30例多胎分娩,2PN來源囊胚移植的新生兒4例畸形(卵圓孔閉合2例、右手拇指缺如1例,以及肛門閉鎖1例出生后存活10 d)。

本研究還有一些不足之處,比如由于未對凍融囊胚移植周期的流產絨毛進行核型分析,因此不能確定0PN來源囊胚如此高的流產率是否由于染色體異常所致。

綜上所述,接受常規(guī)體外受精-胚胎移植治療的患者卵巢儲備情況可能會對0PN來源胚胎的形成有一定影響;與2PN來源囊胚相比,0PN來源囊胚移植后流產率、活產率存在一定差異,但在患者無2PN來源胚胎可移植的情況下,0PN來源囊胚移植提高了胚胎利用率,降低了患者診療費用,減少了患者精神及身體上的痛苦,有很大利用價值。當然0PN來源囊胚移植的風險也是一個值得關注的問題,Time-lapse時差培養(yǎng)箱及植入前診斷技術是目前盡量避免這類風險的有效途徑。