生物胺降解菌Staphylococcus xylosus JCM 2418 的特性研究及應用

張楊，李歆宇，馬新秀，畢景然，張公亮，侯紅漫

（大連工業大學 食品學院，遼寧 大連 116034）

發酵是最古老的食品保存方法之一，在世界范圍內都有較廣泛的應用，也是一種生產具有獨特感官特征食品的加工方法。發酵食品因其獨特的風味和豐富的營養而受到廣大消費者的青睞，是人們飲食的重要組成部分[1-2]。微生物在發酵食品感官品質形成中起到重要的作用，能夠將糖、肽和脂質轉化為有機酸、醇類物質、揮發性和芳香化合物、多糖和其他影響發酵食品質量特性、安全性和保質期的代謝物[3]。

生物胺是一類具有生物活性、含氨基的低分子量有機化合物的總稱[4]，存在于多種食品尤其是發酵食品（如奶酪、葡萄酒、啤酒、米酒、發酵香腸、調味品）、水產品及肉類產品等[5]。適量攝入生物胺能促進生長、增強代謝活力、增強免疫力和清除自由基等，但是過量攝入生物胺則會引起頭疼、腹部痙攣、嘔吐等不良生理反應[6]。生物胺含量過高是發酵食品生產過程中常見的問題，目前，利用具有降解生物胺能力的菌株來減少食品中生物胺的積累是較有優勢和應用前景的方法。

從發酵制品中獲得的微生物作為發酵劑應用在發酵食品中，不僅可以提高產品安全性，同時能有效縮短發酵周期，提升產品品質，有利于產品的標準化、工業化生產[7]。目前，微生物發酵劑在水產類和肉制品類發酵制品中應用較多。Liao 等[8]將植物乳桿菌和木糖葡萄球菌作為發酵劑接種到傳統發酵魚中，并對生物胺含量進行了監測，發現混合發酵劑對生物胺有降解的作用，尤其是對酪胺；楊洋等[9]以發酵乳桿菌作為帶魚加工下腳料的功能發酵劑用于魚露生產，發現該菌株可以使魚露生物胺含量降低，并改善魚露風味；Hu等[10]將戊糖片球菌、彎曲乳桿菌和木糖葡萄球菌接種到哈爾濱香腸中，考察其對哈爾濱干發酵香腸品質和風味的影響，發現香腸的硬度和彈性得到提高，產生了更高比例的揮發性化合物。

木糖葡萄球菌是《可用于食品的菌種名單》[11]中的菌種，但本研究中的Staphylococcus xylosus JCM 2418是從魚露中篩選得到的，鑒于此，對Staphylococcus xylosus JCM 2418 的安全性及發酵性能進行評價，并利用高效液相色譜和電子鼻分析該菌株單菌接種在不同發酵食品中對生物胺以及揮發性風味物質的影響，以期為發酵產品提供優良的發酵菌劑提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Staphylococcus xylosus JCM 2418、蠟樣芽胞桿菌：大連工業大學食品學院保藏；魚露：大連工業大學水產品加工質量安全與控制重點實驗室自行發酵；酸菜、大醬：市售。

氫氧化鈉、碳酸氫鈉、丹磺酰氯、草酸銨結晶紫、三丁酸甘油酯瓊脂、β-苯乙胺、腐胺、組胺、精胺、亞精胺、紅霉素、鏈霉素、鏈霉素、四環素、壯觀霉素、克林霉素、卡那霉素、氨芐西林、甘油三丁酸酯、色胺、尸胺、酪胺（均為分析純）：大連美侖生物試劑有限公司；乙腈（色譜純）：美國Sigma 公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）、丙酮、氨水（均為分析純）、脫脂乳粉（食品級）：上海生工生物工程股份有限公司；LB 肉湯、LB 瓊脂、水解酪蛋白胨肉湯：青島海博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平（GN1324）：上海民橋精密科學儀器有限公司；高效液相色譜儀（1260）：美國Agilent 公司；便攜式電子鼻（PEN3）：德國Airsence 公司；紫外分光光度計（UV-1750）：日本島津公司；pH 計（FE28）：上海Mettler Toledo 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株安全性評價

1.3.1.1 耐藥性試驗

耐藥性試驗在96 孔細胞培養板中進行，采用微量肉湯稀釋法測定菌株的最低抑菌濃度[11]。8 種抗生素從常用的檢測葡萄球菌抗生素敏感性的抗生素中選出。將每種抗生素的最小抑制濃度（minimal inhibitory concentration，MIC） 記錄為在孔中未觀察到混濁的最低濃度，進行5 次獨立試驗。

1.3.1.2 溶血性試驗

溶血性測試[12]是將S.xylosus JCM 2418 在含有5%（體積分數）綿羊血的LB 瓊脂板上劃線，在37 ℃孵育48 h 后測定α-溶血性，然后在4 ℃放置24 h 測定β-溶血性。溶血性是通過觀察每個LB 血平板上的菌落周圍是否形成清晰的溶血區來確定的。Bacillus cereus用作陽性對照，進行5 次獨立試驗。

1.3.1.3 生物膜形成試驗

根據Zhu 等[13]的方法，使用96 孔板法測定生物膜形成情況。無菌培養基作為陰性對照，金黃色葡萄球菌ATCC6538 作為陽性對照來分析生物膜形成情況。

1.3.2 菌株發酵性能鑒定

1.3.2.1 耐鹽性能鑒定

在LB 肉湯培養基中添加不同濃度（1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%，質量濃度）的NaCl，配制不同鹽濃度的培養基。菌液渾濁后（OD600nm=1.0），以1%（體積分數）接種量于37 ℃分別培養，觀察其生長情況并記錄。

1.3.2.2 蛋白酶活性試驗

配制不同鹽濃度（5%、10%、15%，質量濃度）的LB固體培養基，同時在培養基中加入2%（質量濃度）的脫脂乳粉，105 ℃滅菌5 min。以接種量為100 μL，37 ℃恒溫培養箱培養5 d[14]。如果菌落周圍有透明環，則證明菌株具有蛋白酶活性。

1.3.2.3 脂肪酶活性試驗

配制不同鹽濃度（5%、10%、15%，質量濃度）的三丁酸甘油酯瓊脂培養基，121 ℃滅菌20 min 后，使培養基溫度穩定在60 ℃左右，無菌條件下加入1%（體積分數）甘油三丁酸酯。以接種量為100 μL，37 ℃恒溫培養箱培養5 d[14]。如果菌落周圍有透明環，則證明菌株具有脂肪酶活性。

1.3.3 菌株生物胺降解相關酶類型及分布

1.3.3.1 生物胺降解相關酶活性鑒定

考察菌株中與生物胺降解相關酶——胺氧化酶和氨基酸脫羧酶是否存在，配制脫羧酶液體培養基[15]，孵育菌株，培養基變為紫色證明菌株具有氨基酸脫羧酶活性；如果培養基變成黃色，表明S.xylosus JCM 2418 可能具有胺氧化酶活性。

1.3.3.2 生物胺降解相關酶的分布

S.xylosus JCM 2418 在LB 液體培養基孵育，24 h后以6 000×g 轉速離心10 min。取上清液作為細胞外組分；用4 ℃的PBS 洗滌菌體并均質，取一半菌液作為完整細胞組分；用研磨器研磨另一半菌液，在4 ℃條件下再次以6 000×g 轉速離心10 min，收集上清液作為細胞內組分；沉淀用PBS 洗滌并均質，將其作為細胞膜組分。分別加入生物胺，使各生物胺的終濃度均為500 mg/L，培養48 h 后檢測生物胺的含量[16]。

1.3.4 菌株在不同發酵食品中的應用

將菌液按3%的接種量接種至大醬、酸菜和魚露中，發酵30 d，每5 d 取一次樣品，對樣品的生物胺降解率、pH 值以及風味進行檢測。

1.3.4.1 生物胺降解率

根據Sang 等[17]的方法測量每個發酵食品樣品中的總生物胺含量。將20 mL 10% TCA 添加到5 g 樣品中混勻，獲得樣品生物胺提取液，進行衍生化后檢測并計算。生物胺降解率計算公式如下。

式中：M 為生物胺降解率，%；A 和B 分別為對照組和接菌組生物胺含量，mg/kg。

1.3.4.2 pH 值稱取5 g 樣品，加入到45 mL 滅菌水中均質至樣品均勻懸浮，用pH 計測定樣品中的pH 值。

1.3.4.3 揮發性氣味組分

使用便攜式電子鼻在（23±2）℃下檢測樣品的特征風味。參考Ma 等[14]的方法，將精確量（10.0 g）的每個樣品放入50 mL 離心管中進行風味檢測。

1.4 數據分析

結果以平均值±標準差的形式表示，所有統計分析均基于重復試驗3 次，使用SPSS 26 軟件分析數據，采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，One-Way ANOVA）確定菌株之間的差異是否著，使用鄧肯式多重比較在5%水平評估處理樣品之間差異的顯著性，以P＜0.05 表示具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 Staphylococcus xylosus JCM 2418 的安全性能評價

對抗生素的抗性是選擇發酵劑安全性的主要考慮問題之一[18]。本研究對特定抗生素的耐藥性是指被測抗生素的MIC 值高于歐洲抗菌藥物敏感試驗委員會（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）定義的Enterococcus 屬斷點值。MIC高于斷點的菌株被視為抗藥性菌株[19]。除了抗生素敏感性外，還考慮了菌株的溶血活性和生物膜形成這兩項指標。具有溶血活性的微生物菌株可能產生外毒素，例如鏈球菌溶血素，其可通過降解鞘磷脂完全溶解紅細胞，導致人體缺血、缺氧，更嚴重的會導致昏厥和腦梗死[20]。

S.xylosus JCM 2418 的藥敏性試驗結果見表1。

表1 S.xylosus JCM 2418 的藥敏性試驗結果Table 1 Drug susceptibility testing results of S.xylosus JCM 2418

由表1 可知，菌株對每種抗生素敏感的最低濃度值均低于歐洲抗菌藥物敏感試驗委員會2020 年提供的斷點值，S.xylosus JCM 2418 對通常用于檢測葡萄球菌耐藥性的抗生素敏感，表現出較弱的耐藥性，因此，就抗生素敏感性而言，S.xylosus JCM 2418 可以被認為在發酵食品的應用上是安全的。

S.xylosus JCM 2418 的溶血性試驗結果見圖1。

圖1 S.xylosus JCM 2418 的溶血性試驗Fig.1 Hemolytic experiment of S.xylosus JCM 2418

從圖1 中可以看出，一種已知的溶血性菌株蠟樣芽胞桿菌在LB 瓊脂上生長時，在菌落周圍形成了非常清晰的區域，而S.xylosus JCM 2418 沒有表現出溶血活性，分析S.xylosus JCM 2418 溶血活性的缺失可能會消除潛在的溶血風險。

另一種可能對發酵產品造成安全問題的主要因素是細菌的生物膜，生物膜是一種細菌自我保護的生長方式，病原菌和腐敗菌可以附著在能夠接觸食物的固體表面上。這些細菌隨后可能形成生物膜，生物膜將使細胞對清潔處理產生更強的抵抗力，并可能會在后續加工過程中污染其他食品[13]。這將促進細菌通過被污染的食品傳播給消費者，最終導致人體被感染，生物膜被認為是細菌感染的常見來源[21]。根據試驗結果，陰性對照組OD590nm平均值為0.168，標準偏差為0.012，S.xylosus JCM 2418 的OD590nm為0.136，通過生物膜成膜量的評判標準[22]計算，S.xylosus JCM 2418 沒有生物膜產生，這表明將其用于發酵食品的生產是不具有風險的。

2.2 Staphylococcus xylosus JCM 2418 的發酵性能評價

S.xylosus JCM 2418 的耐鹽性見圖2。

圖2 S.xylosus JCM 2418 的耐鹽性Fig.2 Salt tolerance of S.xylosus JCM 2418

從圖2 中可以看出，當培養基中NaCl 濃度達到20%時，菌株仍可以生長，但當菌株在25% NaCl 的培養基中培養時，菌種生長緩慢，可以認為菌株是一株耐鹽菌，能夠在高鹽環境中生長繁殖。

不同鹽濃度下S.xylosus JCM 2418 的發酵性能見圖3。

圖3 不同鹽濃度下S.xylosus JCM 2418 的發酵性能Fig.3 Fermentation performance of S.xylosus JCM 2418 under different salt concentrations

從圖3A 中可以看出，S.xylosus JCM 2418 菌落周圍有透明圈，說明其具有蛋白酶活性，且隨著鹽濃度的增加，蛋白酶活性呈下降趨勢，說明它具有發酵魚露、蝦醬、香腸等高蛋白食品的能力[23]。從圖3B 中可以看出，S.xylosus JCM 2418 菌落周圍也有透明圈，說明其具有脂肪酶活性，且鹽濃度對菌株的脂肪酶活性影響不大，這表示它可以作為高脂肪食品的發酵劑。

2.3 Staphylococcus xylosus JCM 2418 的生物胺降解相關酶初步研究

生物胺的積累主要是有兩方面原因，一方面是氨基酸脫羧酶發揮作用，促進生物胺的產生，另一方面是胺氧化酶對生物胺的氧化作用，使生物胺分解代謝[15]。據報道胺氧化酶主要分布在細胞膜或細胞質上[22]，為了確定S.xylosus JCM 2418 的胺氧化酶所處的位置，本研究對S.xylosus JCM 2418 培養后的不同組分進行了處理，并分別與其完整細胞的生物胺降解能力進行比較。

生物胺降解相關酶類型及分布見圖4。

圖4 生物胺降解相關酶類型及分布Fig.4 Types and distribution of biogenic amine degrading enzymes

從圖4A 中可以看出，S.xylosus JCM 2418 的氨基酸脫羧酶試驗結果顯色反應呈黃色，所以S.xylosus JCM 2418 具有胺氧化酶活性，可能不具有氨基酸脫羧酶活性，說明在食品發酵過程中可能不會導致生物胺的積累，并且可能具有降解生物胺的能力；從圖4B 中可以看出，S.xylosus JCM 2418 在細胞內、外兩個組別中生物胺降解率均低于3%，說明在這兩個位置胺氧化酶活性并不高，而在細胞膜和完整細胞這兩個組別中顯示出對生物胺較高的降解能力，但是細胞膜中的生物胺降解率稍低于完整細胞，導致這一情況的原因可能歸結于在破碎過程中造成了部分胺氧化酶的失活。因此，可以得出S.xylosus JCM 2418 的胺氧化酶主要位于其細胞膜上。

2.4 Staphylococcus xylosus JCM 2418 的應用潛力

2.4.1 Staphylococcus xylosus JCM 2418 對發酵食品中生物胺降解率的影響

控制發酵食品中生物胺的含量對于生產優質安全的產品非常重要。接種S.xylosus JCM 2418 可以有效減少發酵期間這些生物胺的積累。

S.xylosus JCM 2418 對發酵食品中生物胺的降解能力見圖5。

圖5 S.xylosus JCM 2418 對發酵食品中生物胺的降解能力Fig.5 Ability of S.xylosus JCM 2418 to degrade biogenic amines in fermented food

從圖5 中可以看出，對于大醬來說，對腐胺、亞精胺和精胺的降解率分別可以達到59.9%、61.8%和43.9%；對于酸菜來說，對腐胺、尸胺和組胺的降解率分別可以達到30.4%、28.3%和31.1%；對于魚露來說，對色胺、腐胺和酪胺的降解率分別可以達到43.7%、36.2%和30.2%。通過以上數據表明發酵劑S.xylosus JCM 2418 可以有效抑制發酵食品中生物胺的積累。

發酵30 d 后，接種S.xylosus JCM 2418 對生物胺的降低能力仍起作用。以魚露為例，接種S.xylosus JCM 2418 后，可以延緩魚露中腐胺降解率下降的速度；而且其中組胺的降解情況隨著腐胺的改變規律改變，在發酵15 d 時組胺和腐胺的降解率均達到最高。組胺毒性的高低與尸胺、腐胺等其它胺類的吸收濃度和存在情況有關。過量攝入組胺可能會導致頭痛和高血壓等癥狀[24]。根據圖5 數據，可以看出接種S.xylosus JCM 2418 后，這3 種發酵食品中組胺的降解率最高可達30%，整個發酵過程中組胺降低能力較好，尤其是酸菜，在發酵30 d 后組胺降解率仍可達20%，其它兩種發酵食品中組胺降解率在15%左右，說明添加發酵劑S.xylosus JCM 2418 可以有效抑制組胺的積累，間接控制了生物胺過量帶來的食品安全風險。

2.4.2 Staphylococcus xylosus JCM 2418 對發酵食品中pH 值的影響

在發酵食品中，不同種類乳酸菌產生的乳酸和乙酸導致pH 值降低，而代謝物和揮發性化合物的形成使pH 值升高。發酵早期階段的各種代謝物的產生可能是pH 值波動的原因。隨著發酵進行，pH 值漸漸處于降低或平穩狀態的趨勢，這可能主要由于氨和胺等堿性含氮物質顯著降低所致[25]。

S.xylosus JCM 2418 對發酵食品pH 值的改變見圖6。

圖6 S.xylosus JCM 2418 對發酵食品pH 值的改變Fig.6 Changes of pH of fermented foods by S.xylosus JCM 2418

從圖6 中可以看出，pH 值隨著發酵進行逐漸降低并趨于平穩，與對照組相比，試驗組的pH 值下降幅度更大。已知較低的pH 值能有利于生產優質安全的食品[26]。高pH 值可能表明產品已經變質，并且可能已經產生了一些有害物質，由此可知，S.xylosus JCM 2418的接種有利于提高食品安全性。

2.4.3 Staphylococcus xylosus JCM 2418 對發酵食品中風味的影響

應用電子鼻中的金屬氧化物半導體傳感器，通過模擬人體嗅覺系統來區分發酵食品的風味特征。近年來，應用發酵劑改善發酵食品風味的報道屢見不鮮。Zhou 等[27]的研究評估了乳酸菌對低鹽發酵鯖魚調味料理化特性的影響，乳酸菌發酵鯖魚調味料的風味優于傳統魚露。

S.xylosus JCM 2418 對發酵食品風味的改變見圖7。

圖7 S.xylosus JCM 2418 對發酵食品風味的改變Fig.7 Changes of the flavor of fermented food by S.xylosus JCM 2418

從圖7 中可以看出，W1S、W1W、W2W 和W5S 4個傳感器分別監測到的甲基類、硫化物、醇類以及氮氧化合物對3 種發酵產品的風味貢獻最大，大醬和酸菜樣品中也檢測到有機硫化物的貢獻，魚露樣品中還檢測到苯類化合物的貢獻，該結果已得到先前報道的證實[28]。與此同時，可以直觀地看到大醬和魚露發酵過程中整體的風味物質變化是先增加后趨于穩定，酸菜發酵過程中整體的風味物質變化是先增加后減少。

含氮含硫類化合物是發酵食品中主要的揮發性風味物質之一，主要呈蔬菜香、洋蔥香等[29]；吡嗪類物質是醬的特征性風味物質，呈現的主要是肉香味和烤香味[30]。含氮含硫類化合物是發酵食品中種類最多含量最高，且隨發酵變化明顯的化合物，從一定程度上影響著最終產品的風味。醇類化合物的閾值通常較高，醇類主要是通過脂質氧化而產生的，隨著發酵的進行醇類化合物一般具有芳香、植物香、酸敗和土霉味。榮良燕等[31]發現，與商業發酵劑相比，木糖葡萄球菌和副干酪乳桿菌組合發酵的香腸總體可接受性相對較高，且庚醛、1-辛烯-3-醇等愉悅風味物質為該組獨有，表現出更加濃郁甜香味。所以，根據電子鼻的檢測結果，可以認為S.xylosus JCM 2418 的接種使發酵食品的含硫含氮類以及醇類化合物的揮發性成分含量升高，使發酵食品的味道更濃郁。

3 結論

Staphylococcus xylosus JCM 2418 是一株相對安全的革蘭氏陽性菌，具有蛋白質水解能力和脂肪水解能力，可以在20% NaCl 的濃度環境中生長。因此，具有應用到高鹽高蛋白發酵食品中的潛力。將S.xylosus JCM 2418 應用到大醬、酸菜和魚露中，pH 值均呈降低的趨勢；風味呈增強的趨勢，S.xylosus JCM 2418 的接種可以使發酵食品具有更濃郁的味道。在大醬中，腐胺、亞精胺和精胺的降解率分別可以達到59.9%、61.8%和43.9%；在酸菜中，腐胺、尸胺和組胺的降解率分別可以達到30.4%、28.3%和31.1%；在魚露中，色胺、腐胺和酪胺的降解率分別可以達到43.7%、36.2%和30.2%。以上可以說明，S.xylosus JCM 2418 的接種可以減少發酵食品中由于過量生物胺的積累引發的食品風險。后續將結合基因方面的試驗對S.xylosus JCM 2418 降解生物胺的機制進行更深入的研究。