沙芥乳酸菌發酵飲料的工藝優化

馬程，烏云達來，王莉梅，康連和，李星云，白烏日力嘎，閆小杰

（1.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010000；2.呼和浩特民族學院，內蒙古 呼和浩特 010051；3.內蒙古農業大學 草原與資源環境學院，內蒙古 呼和浩特 010051；4.內蒙古民族大學，內蒙古 通遼 028000）

沙芥[Pugionium cornutum（L.）Gacrtn.]，十字花科植物，又名沙蘿卜、沙蓋，二年生植物。蒙藥中沙芥以根入藥，莖葉無明確利用方式，但是沙芥莖葉占總株比例較大，占全株的2/3，莖葉一年可多次刈割，產量大，成本低。隨著內蒙古地區蒙藥植物種植規模化發展，對莖葉的利用不足不僅會導致其生物活性資源浪費，還會降低當地農牧民種植沙芥的積極性。沙芥防風固沙能力強，能改善當地的生態系統，被稱作“沙漠英雄”。

沙芥具有鎮痛止咳、消食解毒、提高機體免疫力等功效[1-3]，被廣泛應用于蒙藥中。沙芥具有很高的價值[4-5]，既可以當做日常食品來食用，也可以作為中藥材達到防病治病的目的，是沙區牧民的重要蔬菜之一。沙芥不僅具有豐富的營養物質，還含有黃酮、生物堿、甾醇等化學物質[6-8]，多數在草原地帶與沙區地帶生長[9]。內蒙古沙漠戈壁地區分布較多，少水多干旱、植被覆蓋較少、不適宜居住和畜牧，在沙漠中少有植物生長，而沙芥屬于其中分布最廣的植物之一[10]。

益生菌是一種能改善和增強人體腸道菌群平衡的活性微生物，對人體整體健康和生理機制的發展具有良好的影響和促進作用[11]。使用益生菌等生物發酵技術開發營養和多功能發酵果蔬汁飲料，不僅可以延長果蔬汁的保質期還能抑制其他真菌的生長，也能使飲料獲得更好的發酵風味和較高的營養價值[12]。同時，利用益生菌乳酸菌微生物發酵技術，不僅可以優化果蔬汁的風味，還具有改良果蔬汁風味[13-16]、促進人體消化系統健康、提高果蔬汁營養價值、增強機體免疫力等作用[17-20]。本文利用3 種乳酸菌發酵沙芥，改善沙芥辛辣的口味，以期為沙芥生產加工提供思路以及理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙芥：來自內蒙古烏審旗農牧民家；乳酸菌（植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌）：保藏于內蒙古自治區農牧業科學院實驗室。

1.2 儀器與設備

JL-CJ-H1B 超凈工作臺：上海靳瀾儀器制造有限公司；YXQ-50A 立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；UV-1800 紫外可見分光光度計：翱藝儀器（上海）有限公司；XK96-A 快速混勻器：姜堰市新康醫療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沙芥青汁的制備

首先挑選無病蟲害的沙芥，用清水清洗去掉表面污垢之后，用90 ℃以上的蒸餾水漂燙5 min，起到破酶作用。將破酶的沙芥放入冷水降溫，切段后打漿榨汁，按照沙芥漿∶水=1∶4（體積比）的比例進行稀釋后用兩層紗布過濾，獲得沙芥青汁。

1.3.2 滅菌、接種發酵

經115 ℃滅菌15min 后的沙芥青汁，冷卻至40 ℃，在無菌條件下，接種已經活化好的植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌3 種菌種，放入恒溫培養箱中培養，發酵后于4 ℃冰箱中保存。

1.3.3 復合乳酸菌組成比例確定

將制備好且傳代至少3 代，活化后的3 種菌。植物乳桿菌（記為a 菌）、嗜熱鏈球菌（記為b 菌）、保加利亞乳桿菌（記為c 菌）按照2%的接種量分別接種到液體MRS 培養基中，每隔2 h，測定3 種菌的OD 值、酸度以及活菌數，以1%～7%的接種量分別接入到沙芥汁中，36 ℃條件下，培養16 h，測定活菌數與酸度，研究不同接種量對發酵的影響。根據單菌發酵結果，以活菌數為主要指標，酸度為次要指標，得出最佳的菌株添加量，以最佳條件相鄰兩水平進行三因素三水平正交試驗，通過正交試驗與驗證試驗測定發酵液活菌數與酸度，以此得到沙芥汁發酵的最佳乳酸菌添加比例。

1.3.4 工藝優化試驗設計

取適量沙芥青汁于錐形瓶，60 ℃殺菌30 min 后放置至室溫，以沙芥青汁發酵液中的活菌數與酸度作為考察指標，進行單因素試驗。單因素條件包括復合乳酸菌接種量1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，發酵溫度33、36、39、42、45 ℃，發酵時間0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h，蔗糖添加量1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%。

根據單因素試驗結果，選取發酵時間、發酵溫度、復合接種量為考察因素，以酸度和活菌數為指標，采用L9（33）正交試驗設計，研究沙芥汁發酵的最優工藝條件。

1.3.5 感官評價

根據上述最佳工藝條件制備沙芥乳酸菌發酵飲料，進行成品品質測定。選擇10 位農科院研發專員，其中5名男性，5 名女性，年齡為25～45 歲，評價標準見表1。

表1 沙芥乳酸菌發酵飲料的感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard for fermented beverages made of Pugionium cornutum lactic acid bacteria

1.4 數據處理

將每次試驗重復3 次，數據均以平均值表示。試驗數據采用SPSS22.0 進行處理。

2 結果與分析

2.1 復合發酵菌配比

2.1.1 3 種菌的生長曲線

不同發酵時間條件下3 種菌菌濃度的變化情況見圖1。不同發酵時間條件下3 種菌活菌數的變化情況見圖2。

圖1 不同發酵時間3 種菌菌濃度的變化Fig.1 Changes in the concentrations of three kinds of bacteria at different time

圖2 不同發酵時間3 種菌活菌數的變化Fig.2 Changes in the viable bacteria counts of three kinds of bacteria at different time

由圖1～圖2 可知，3 種菌符合微生物的生長規律。通過對3 種菌OD 值以及菌濃度的分析，明確了3 種菌在不同時期的不同發酵特性，3 種菌在16 h 時均處于穩定期，初步可以擬定穩定的發酵時間為16 h。b 菌OD 值在12 h 后基本趨于穩定，但是活菌數在相同發酵時間卻呈下降趨勢，這說明菌濃度雖然小幅度增大或者基本不變，但其中一部分菌已經失去活性，導致活菌數呈下降的趨勢。

不同發酵時間條件下3 種菌pH 值與酸度的變化見圖3～圖4。

圖3 不同發酵時間3 種菌pH 值的變化Fig.3 Changes of pH of three kinds of bacteria at different time

圖4 不同發酵時間3 種菌酸度的變化Fig.4 Changes of acidity of three kinds of bacteria at different time

由圖3 和圖4 可知，可以看出3 種菌pH 值與酸度變化的趨勢整體相似，隨著發酵時間增長，酸度上升，上升到一定程度后保持穩定。且a 菌和c 菌在培養液為發酵條件的基礎上，發酵能力均高于b 菌。根據試驗結果可知，3 種菌在發酵時間14～18 h 內產酸能力，活菌數較高，說明這個發酵時間段內，a、b、c 3 種菌的發酵能力較強。

2.1.2 單菌不同接種量對發酵的影響

將活化后的3 種乳酸菌在無菌條件下以不同接種量（1%～7%）接種到沙芥青汁中，發酵溫度36 ℃于培養箱中培養16 h，測定活菌數與酸度，結果如圖5 所示。

一般條件下，益生菌活菌數越多，發酵能力越強。適量地增加接種量會加快乳酸菌的生長，節省發酵時間，但是當接種量過大，又會抑制乳酸菌的生長，導致活菌數數量下降。由圖5 可知，當3 種菌在接種量為3%～5%時，活菌數和酸度表現較好。選取接種量3%、4%、5%3 個水平參加正交試驗，從而確定3 種菌復合的比例。

2.1.3 復合菌發酵試驗

2.1.3.1 復合乳酸菌接種比例的確定

復合乳酸菌接種比例的正交試驗設計與結果如表2 所示。

表2 復合乳酸菌接種比例的正交試驗設計與結果Table 2 Orthogonal experimental design and results of the inoculation ratio of composite lactic acid bacteria

由表2 可知，以活菌數為指標時，3 種乳酸菌對于沙芥汁發酵的影響大小分別為a＞b＞c，即影響活菌數的主要因素為a 菌，其次是b 菌和c 菌，3 種菌復合的最佳比例為a1b1c1，從另一輔助指標酸度來看，根據正交試驗進行極差分析，3 種乳酸菌對于酸度的影響大小分別為c＞b＞a，即影響酸度的主要因素為c 菌，其他次要因素為b 菌和a 菌，綜合分析，選取3 種菌復合的比例a2b3c1為最佳。

根據人體胃酸環境要求，選取3 個組合進行驗證試驗，結果見表3。

表3 驗證試驗Table 3 Validation experiment

根據驗證試驗數據分析，根據試驗主要指標為活菌數來看，a2b2c1活菌數最高，且酸度最高。因此3 種菌復合的最佳比例確定為a 菌∶b 菌∶c 菌=4∶4∶3（質量比）。

2.1.3.2 復合乳酸菌接種量的確定

復合菌接種量對活菌數和酸度的影響見圖6。

圖6 復合菌接種量對活菌數和酸度的影響Fig.6 Effect of compound bacteria inoculation amount on the number of viable bacteria and acidity

由圖6 可知，不同接種量的復合乳酸菌在相同的發酵條件下，沙芥汁發酵液的活菌數隨著接種量的增加而增加，在接種量達到5%時，酸度與活菌數均達到最高，此時，酸度為0.87 °T，活菌數為1.26×109CFU/mL；當接種量為5%時，活菌數與其他組有明顯差異，酸度與其他組差異不大；當繼續增加接種量，活菌數和酸度開始下降，說明當接種量達到了一定程度，反而不利于乳酸菌的發酵，抑制了乳酸菌的發酵。由試驗數據分析，選擇最佳條件相鄰兩水平，即復合菌接種量為4%、5%、6% 3 個水平進行后續正交試驗。

2.2 沙芥青汁發酵條件的優化

2.2.1 發酵溫度對沙芥汁發酵的影響

不同發酵溫度對活菌數和酸度的影響見圖7。

圖7 不同發酵溫度對對活菌數和酸度的影響Fig.7 Effect of different fermentation temperatures on the number of viable bacteria and acidity

適宜的發酵溫度可以促進乳酸菌的發酵，過高或者過低的發酵溫度都會抑制乳酸菌的發酵活性。由圖7 可知，發酵溫度為33、36、39 ℃時，酸度變化不大，無明顯差異，39 ℃時，酸度達到最高，為0.79°T，活菌數隨著發酵溫度遞增而增加，39 ℃達到最高，為0.94×109CFU/mL。當發酵溫度超過39 ℃，達到42 ℃及以上時，活菌數急速下降，說明發酵溫度過高，抑制了乳酸菌的發酵，導致活菌數小于1×107CFU/mL。同樣地，酸度也有明顯下降。發酵溫度過高，不僅影響乳酸菌的發酵活菌數，也同樣影響沙芥發酵液的酸度，從而改變了乳酸菌的發酵環境，使得沙芥發酵液活菌數急劇減少。分析數據可知，33、36、39 ℃時，活菌數均大于108CFU/mL。根據試驗結果，選取33、36、39 ℃3 個發酵溫度參與后續正交試驗。

2.2.2 發酵時間對沙芥汁發酵的影響

不同發酵時間對活菌數和酸度的影響見圖8。

圖8 不同發酵時間對活菌數和酸度的影響Fig.8 Effect of different fermentation time on the number of viable bacteria and acidity

乳酸菌的發酵過程是利用原料產生乳酸等產物的過程，在不同的發酵時間內，沙芥汁發酵液產生的乳酸產物量不同，隨著發酵時間的增長，乳酸產物會不斷積累，從而影響沙芥青汁中乳酸菌的發酵。由圖8可知，在14、16、18 h 時，活菌數以及酸度結果較好。16 h 為最佳發酵時間。

2.2.3 蔗糖添加量對沙芥發酵液的影響

不同蔗糖添加量對發酵的影響圖9 所示。

圖9 不同蔗糖添加量對活菌數和酸度的影響Fig.9 Effect of different sucrose addition levels on the number of viable bacteria and acidity

由圖9 可知，以活菌數為評價指標，隨著蔗糖添加量的增加，活菌數變化不顯著（p＞0.05），以酸度為評價指標酸度變化同樣不顯著（p＞0.05）。說明蔗糖添加量在沙芥青汁的發酵過程中對活菌數與酸度均無顯著影響，因此，在后續正交試驗中，不考慮此因素。

2.2.4 最佳工藝正交試驗

在單因素的基礎上，以發酵時間、發酵溫度、接種量3 個因素，以活菌數作為主要評價指標，酸度作為次要評價指標，選用L9（33）正交試驗表，根據試驗結果，篩選出最佳發酵條件，正交試驗結果見表4。

表4 正交試驗結果Table 4 Results of orthogonal experiments

由正交結果數據可知，以酸度為評價指標，影響的主次因素為A＞C＞B，說明在沙芥發酵過程中，發酵時間和發酵溫度對發酵液酸度影響較大，其次是菌種接種量，最優水平為A3B2C3，但在試驗組中，酸度最高的組別是A3B1C3，酸度達到了0.90 °T。以沙芥發酵液中所含的活菌數為評價指標，比較R 值大小可知，發酵溫度和接種量為沙芥發酵液所含活菌數的主要影響因素，發酵時間為次要影響因素，即發酵溫度與接種量對沙芥發酵液的活菌數產酸影響大。根據正交得出最優水平為A2B2C1，但是試驗組活菌數最多的組別為A1B1C1。

驗證試驗結果如表5 所示。

根據活菌數指標來看，A1B1C1活菌數最高，根據酸度指標來看，變化不明顯，所以選擇A1B1C1作為發酵的最優工藝。即發酵14 h，發酵溫度33 ℃，接種量4%。

2.2.5 感官評價

對A1B1C1制備的飲料進行了感官評價，評價結果見表6。

表6 感官評價結果Table 6 Sensory evaluation results

由表6 可知，沙芥飲料組織狀態均勻，無沉淀，色澤呈綠色，具有沙芥固有的清香氣味，微酸，微甜，口感較好。

3 結論

本研究以沙芥為單一原料，采用植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌的復合菌發酵沙芥汁制成乳酸菌飲料，以乳酸菌活菌數和酸度含量作為評價指標，通過單因素試驗和正交試驗確定了復合菌的體積比為：植物乳桿菌∶嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌=4∶4∶3（質量比）；最佳發酵工藝為發酵溫度33 ℃、發酵時間14 h、接種量4%；此研究所用原料獨特、風味獨特、制備工藝簡單，為沙芥乳酸菌發酵飲料的生產和加工提供了一定的理論基礎和試驗支撐。