水蜜桃多酚的抗氧化、抗菌和抗腫瘤活性評價

張紅剛，郭尚

（山西農業大學 山西功能食品研究院，山西 太原 030031）

植物多酚是具有芳香環及羥基取代基的天然化合物的總稱，是植物代謝過程中產生的重要的次級產物之一[1-2]。在自然界中許多植物都產生或含有多酚物質，而且多酚的種類非常多。通常將植物多酚分為兩大類：類黃酮（如黃酮類、黃酮醇類、異黃酮類、查爾酮類等）和非類黃酮（如芪類、單寧、酚酸類等）[3]。研究發現，植物多酚具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤、降血脂血糖、改善心腦血管功能等多種生理活性[4-7]，在食品、保健、制藥等領域得到廣泛的應用[8]。

水蜜桃（Pruuus persica） 在我國許多省份都有種植，因其皮薄汁多，鮮甜可口，備受市場歡迎，其花朵、果實、桃仁等都能夠入藥，在止咳平喘、治療缺鐵性貧血、利尿和抗血凝等方面有療效[9]。當前關于水蜜桃的研究多集中在采后保鮮技術方面，關于水蜜桃活性功效成分的研究較少。多酚是在植物性食物中發現的，主要存在于蔬果、堅果、大豆、茶、可可、酒類之中。因此開展水蜜桃果實中多酚類物質的研究可以進一步提高水蜜桃綜合利用價值和經濟附加值。

本研究以水蜜桃為試驗材料，研究水蜜桃多酚提取物對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS] 陽離子自由基及O2-自由基的清除能力，并測定水蜜桃多酚的抗菌、抗腫瘤活性，以期為水蜜桃多酚在食品、醫藥保健領域的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株和菌株

人胃癌細胞SGC-7901：上海弘順生物科技有限公司；人宮頸癌細胞HeLa：微蒙生物科技（上海）有限公司；金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、啤酒酵母菌、匍枝根霉菌：中國工業微生物菌種保藏管理中心；改良Eagle 培養基（dulbecco's modification of Eagle's medium，DMEM）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：孚約生物科技（上海）有限公司；胰蛋白酶（250 U/mg）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 主要原料、試劑與儀器

新鮮水蜜桃：市售，品種為春蜜。

10%胎牛血清：濟南博航生物技術有限公司；RPM-1640 干粉基：賽默飛世爾科技公司；噻唑藍[3-（4，5 -dimethyl -2 -thiazolyl）-2，5 -diphenyl tetrazolium bromide，MTT]、DPPH、ABTS、三羥甲基氨基甲烷（trometamol，Tris）、鹽酸、冰醋酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

UV755B 分光光度計：上海精密儀器儀表有限公司；HH-S 水浴鍋：江蘇省金壇市醫療儀器廠；R-200 旋轉蒸發儀：步琦實驗室設備貿易（上海）有限公司；P190 全溫振蕩培養箱：北京立信宏達科技有限責任公司；E1x800酶標儀：美國伯騰儀器有限公司；PWT-P75B 恒溫培養箱：合肥達斯卡特科學器材有限公司；DW-86L338J 超低溫保存箱：青島海爾生物醫療股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水蜜桃多酚的提取

將新鮮水蜜桃果實清洗后去核、破碎，用60%乙醇以料液比1:3（g/mL）在55 ℃水浴下提取2 h，再用400 目紗布進行過濾處理，用旋轉蒸發儀進行濃縮操作，得到水蜜桃多酚提取液。

1.3.2 DPPH 自由基清除能力測定

按照Chick 等[10]的方法，稍作修改。反應液包括0.2 mL 不同濃度的水蜜桃多酚樣品液和0.2 mL 濃度為0.2 mmol/L 的DPPH 溶液，進行有效的攪拌混合后，37 ℃避光狀態下持續反應30 min，取反應液并在517 nm 處測定其吸光值。DPPH 自由基清除率（R，%）依據下列公式進行計算。

式中：A樣品為待測液與DPPH 溶液的吸光值；A對照為用無水乙醇代替DPPH 溶液的吸光值；A空白為以無水乙醇和DPPH 溶液的吸光值。

1.3.3 ABTS+自由基清除能力測定

依據Sun 等[11]的方法測定ABTS+自由基清除率。ABTS 反應溶液由ABTS 7 mmol/L 和K2S2O82.45 mmol/L配成，在暗處常溫下靜置16 h 后，在734 nm 調節上述混合液的OD 值為0.7。取0.1 mL 的水蜜桃多酚樣品和3.9 mL ABTS 溶液加入試管中，734 nm 處測吸光值記為A樣品；對照組是0.1 mL 水蜜桃多酚樣品和3.9 mL去離子水混合液，734 nm 處測吸光值記為A對照；空白組是0.1 mL 甲醇溶液和3.9 mL 的ABTS 溶液，734 nm處測吸光值記為A空白。ABTS+自由基清除率（H，%）計算公式如下。

1.3.4 O2-自由基清除能力測定

按照Mvs 等[12]的方法，加3 mL Tris-HCl（50 mmol/L）溶液于試管中，在25 ℃的水浴下靜置20 min，加入1 mL 不同濃度的水蜜桃多酚樣品溶液和0.2 mL 鄰苯三酚溶液（5 mmol/L），攪拌均勻，25 ℃暗處靜置5 min，加入1 mL HCl 溶液（8 mmol/L）終止反應，在325 nm 處測定吸光值。超氧陰離子自由基清除率（Q，%）計算公式如下。

式中：A1為蒸餾水取代樣品的吸光值；A2為樣品的吸光值。

1.3.5 總還原力測定

依據Barreto 等[13]的方法，將1 mL 樣品液、2.5 mL 鐵氰化鉀溶液（0.1 mol/L）、2.5 mL 磷酸鹽液（0.2 mol/L），加入同一支試管，然后放入50 ℃水浴鍋中持續反應30 min，快速冷卻后，加入2.5 mL 三氯乙酸和0.5 mL三氯化鐵，測定700 nm 處吸光值。

1.3.6 抗菌活性測定

按照文獻[14]的方法，挑取一菌落加入100 mL 營養肉湯中，在全溫振蕩培養箱中培養12 h，培養后，將菌液濃度調整為105～106CFU/mL。試管編號后，加入3.7 mL營養肉湯，經過20 min、121 ℃高壓滅菌后取出冷卻，在每支試管中加稀菌液0.3 mL 和樣品溶液1 mL，混合均勻，在37 ℃培養24 h，于600 nm 處測定吸光值。空白對照采用1 mL 的無菌水取代對應的多酚。抗菌活性通過抗菌率來反映，抗菌率（B，%）的計算公式如下。

式中：A對照為1 mL 的無菌水取代多酚的待測液吸光值；A樣品為樣品待測液吸光值。

1.3.7 細胞培養與處理

兩類細胞均放入到10%DMEM 中，37 ℃、5% CO2環境下持續培育。選擇生長狀態較好的人胃癌細胞SGC-7901、人宮頸癌細胞HeLa，對其進行浸泡消化，使用胰蛋白酶完全浸潤細胞，直接放入37 ℃的環境中進行消化，消化時間控制在7～10 min，并得到細胞懸液。

1.3.8 MTT 法測定人胃癌細胞SGC-7901、人宮頸癌HeLa 增殖

將培養的細胞濃度調整為1×104個/mL，接種于96 孔培養板，持續培育48 h 之后，加入20 μL 的MTT（5 mg/mL）溶液，培養4 h，然后培養板各孔分別添加150 μL 的DMSO 溶液進行有效溶解。490 nm 波長環境中測試其具體的吸光值，分析獲得相應增殖抑制率（Z，%），具體公式如下。

式中：A樣品為待測樣品吸光值；A對照為未加入細胞液的MTT 和DMSO 的混合液吸光值。

1.4 數據處理

使用IBM SPSS 20.0.0 軟件對數據進行統計分析，采用origin 2019b 軟件對數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 體外自由基清除能力

2.1.1 水蜜桃多酚提取物對DPPH 自由基的清除能力

水蜜桃多酚提取物對DPPH 自由基的清除能力見圖1。

圖1 水蜜桃多酚提取物對DPPH 自由基的清除能力Fig.1 DPPH·scavenging rate of polyphenol extract of honey peach

DPPH 在有機溶劑中是一種穩定的自由基，其醇溶液呈紫色，自由基清除劑處理后，DPPH 醇溶液的紫色會逐漸改變為穩定狀態的黃色，它的顏色變化程度與接受的電子數量呈正比[15]。

由圖1 可知，隨著水蜜桃多酚提取物的濃度從0.04 mg/mL 增加至0.12 mg/mL，DPPH 自由基清除率從最初的（11.93±1.42）%提升至（81.04±6.81）%。之后變化趨緩，多酚提取物濃度為0.14 mg/mL 與0.16 mg/mL條件下，DPPH 自由基清除率相差不大。多酚提取物濃度為0.16mg/mL時，DPPH 自由基清除率為（89.14±6.82）%。

2.1.2 水蜜桃多酚提取物對ABTS+自由基的清除率

水蜜桃多酚提取物對ABTS+自由基的清除率見圖2。

圖2 水蜜桃多酚提取物對ABTS+自由基的清除率Fig.2 ABTS+·scavenging rate of polyphenol extract of honey peach

ABTS 法操作簡單且有著良好的重復性結果，所以被廣泛用于天然抗氧化劑的體外抗氧化活力的評估[16]。從圖2 可以看出，隨著水蜜桃多酚提取物的濃度從0.04 mg/mL 增加至0.12 mg/mL，ABTS+自由基清除率從（5.63±0.61）%迅速增長至（68.29±5.06）%。之后，ABTS+自由基清除率增加緩慢，在水蜜桃多酚提取物濃度為0.16 mg/mL 時，ABTS+自由基清除率為（75.83±6.36）%。

2.1.3 水蜜桃多酚提取物對O2-自由基的清除率

水蜜桃多酚提取物對O2-自由基的清除率見圖3。

圖3 水蜜桃多酚提取物對O2-自由基的清除率Fig.3 O2-·scavenging rate of polyphenol extract of honey peach

O2-自由基能在生物體內產生，過多積聚則會引起生物體內脂質過氧化，從而誘發各種疾病，破壞生物的正常新陳代謝[17]。從圖3 能夠發現水蜜桃多酚提取物濃度從0.04 mg/mL 增加至0.12 mg/mL 時，對于O2-自由基的清除率，從（7.61±0.69）%增長到（61.64±5.47）%。之后，O2-自由基清除率增加趨勢減緩。在多酚提取物濃度為0.16 mg/mL 時，O2-自由基清除率為（71.55±8.04）%。

2.1.4 水蜜桃多酚提取物的總還原力

水蜜桃多酚提取物的總還原力見圖4。

圖4 水蜜桃多酚提取物的總還原力Fig.4 Total reducing power of polyphenol extract of honey peach

如圖4 所示，水蜜桃多酚提取物的總還原力隨濃度的增加而增大，其濃度從0.04 mg/mL 增加至0.14 mg/mL，多酚提取物的還原力從0.25±0.02 迅速增長到1.36±0.13。之后，總還原力增加趨于穩定，在水蜜桃多酚提取物濃度為0.16 mg/mL 時，總還原力為1.36±0.13。

2.2 體外抗菌活性

水蜜桃多酚提取物的體外抗菌活性見表1。

表1 水蜜桃多酚提取物的體外抗菌活性Table 1 In vitro antibacterial activity effect of polyphenol extract of honey peach%

由表1 可以看出，水蜜桃多酚提取物對6 種菌生長都有抑制效果。多酚樣品對匍枝根霉菌和大腸桿菌的抑菌活性最高。當多酚濃度為7 mg/mL 時，抗菌活性分別達（80.26±5.29）%和（89.53±5.35）%。其次為綠膿桿菌、鏈球菌，當多酚濃度為7 mg/mL 時，抗菌率分別達（70.38±3.79）%和（67.31±5.38）%。水蜜桃多酚樣品對啤酒酵母菌和金黃色葡萄球菌的抑制率相對較弱，當多酚濃度為7 mg/mL 時，抗菌率分別達（60.36±5.28）%和（59.41±4.63）%。結果表明，水蜜桃多酚提取物有一定的抗菌作用。

2.3 體外抗腫瘤活力

水蜜桃多酚提取物的抗腫瘤活力見圖5。

圖5 水蜜桃多酚提取物的體外抗腫瘤活力Fig.5 In vitro anti-tumor activity of peach polyphenol samples

由圖5 可知，水蜜桃多酚提取物對人胃癌細胞SGC-7901 的增殖抑制率隨多酚提取物濃度增加而增強，當多酚提取物濃度為7 mg/mL 時，對人胃癌細胞SGC-7901 的增殖抑制率為（57.20±4.28）%；對于人宮頸癌細胞HeLa 抑制率，同樣表現為隨著多酚提取物濃度提升而不斷增強，當多酚提取物濃度為7 mg/mL時，對人宮頸癌細胞HeLa 增殖抑制率為（40.11±3.99）%。通過對兩組數據進行比較，水蜜桃多酚提取物對人胃癌細胞SGC-7901 的增殖抑制效果比對人宮頸癌細胞HeLa 更優。據此水蜜桃多酚可能通過清除自由基以及抑制腫瘤細胞的相關基因表達、增強免疫途徑等機制來抑制腫瘤細胞的生長。

3 結論

本文通過對水蜜桃多酚提取物對體外自由基清除活力、抗菌活性和抗腫瘤活力等進行試驗評價。發現水蜜桃多酚提取物有一定的抗氧化、抑菌及抗腫瘤效果。其中對體外自由基的清除活力表現出隨著多酚提取物濃度從0.04 mg/mL 增加至0.14 mg/mL，其抗氧化性急劇升高，隨后趨于平緩。抗菌性方面，對大腸桿菌的抑菌活性最高，當濃度為7 mg/mL 時，抗菌率達到（89.53±5.35）%。抗腫瘤方面則表現為不同濃度下的水蜜桃多酚提取物對人胃癌細胞SGC-7901 和人宮頸癌細胞HeLa 均有一定的抑制效果，尤其是對人胃癌細胞SGC-7901 的抑制效果更好，在多酚提取物濃度為7 mg/mL 時，其增殖抑制率可達（57.20±4.28）%。本研究結果為水蜜桃多酚的綜合應用提供了參考依據。