GLP-1類似物利拉魯肽對高糖誘導胰島細胞凋亡及HSP72表達、ERK1/2通路活性的影響

劉璟 金燕霞 秦丹丹 許靜

(荊門市第二人民醫院綜合病房,湖北 荊門 448000)

高血糖是糖尿病主要特征,長期可導致一系列慢性并發癥,嚴重威脅患者生命健康〔1～3〕。胰島細胞是胰島素分泌靶細胞,其凋亡在糖尿病發生發展中起重要作用〔4〕。研究發現,胰島細胞功能的正常維持需要合適的血糖環境,高血糖會導致胰島細胞數量減少及功能損傷〔5～8〕。胰高血糖素樣多肽(GLP)-1是一種腸道內分泌激素,具有多靶點,全面改善糖尿病及其并發癥的優勢〔9〕。作為GLP-1類似物,利拉魯肽可激活GLP-1受體,常用來改善糖尿病及其并發癥〔10,11〕。熱休克蛋白(HSP)72是細胞中最保守且最易在應激反應中被誘導表達的HSPs家族成員〔12〕。細胞外信號調節激酶(ERK)1/2可被多種細胞因子、生長因子激活,介導細胞增殖、凋亡、分化等信號轉導過程〔13〕。本研究旨在研究利拉魯肽對高糖誘導胰島細胞凋亡及HSP72表達、ERK1/2通路活性的影響。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 大鼠胰島INS-1細胞(貨號:HZ-Y3016)購自美國ATCC細胞庫;DMEM培養基(貨號:KL-P0032)購自德國merck/sigma公司;利拉魯肽(貨號:S80523)購自上海源葉生物科技有限公司;膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒(貨號:S0185)購自哈爾濱新海基因檢測有限公司;HSP72、ERK1、ERK2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成;HSP72抗體(貨號:orb137523)購自英國biorbyt;p-ERK1/2抗體、ERK1/2抗體、Bax抗體、GAPDH抗體(貨號:ab223500、ab17942、ab32503、ab181602)購自abcam公司;恒溫培養箱(型號:MIR-162-PC/MIR-262-PC)購自日本松下公司;流式細胞儀(型號:BD FACSCanto Ⅱ)購自美國BD公司;化學發光成像系統(型號:ChemiDocXRS)購自美國Bio-Rad公司;熒光定量PCR儀(型號:ABI 7500)購自美國Applied Biosystems公司。

1.2細胞培養 INS-1細胞在DMEM培養基中培養達到75%左右融合時進行傳代。將100 μl/孔對數期INS-1細胞懸液(5×105個/ml)加入96孔板中,分為對照組(5 mmol/L葡萄糖)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖)、利拉魯肽低劑量組(1 nmol/L利拉魯肽+30 mmol/L葡萄糖)、利拉魯肽中劑量組(3 nmol/L利拉魯肽+30 mmol/L葡萄糖)和利拉魯肽高劑量組(5 nmol/L利拉魯肽+30 mmol/L葡萄糖)。

1.3流式細胞儀檢測INS-1細胞凋亡 將INS-1細胞按照1.2分組處理后培養48 h,用1×結合緩沖液400 μl將細胞重懸(調整濃度為1×106個/ml),向每孔中分別加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI,避光孵育1 h,流式細胞儀分析細胞凋亡。

1.4實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法檢測各組INS-1細胞中HSP72、ERK1、ERK2、Bax mRNA表達情況 TRIzol試劑提取各組INS-1細胞總RNA,逆轉錄合成cDNA,采用qRT-PCR法檢測HSP72、ERK1、ERK2、Bax mRNA表達水平,內參基因為GAPDH。反應程序:95 ℃預變性10 min;95 ℃變性10 s,55 ℃退火35 s,72 ℃延伸1 min,循環40次。HSP72上游引物:5′-CGCAACGTGCTCATC-TTTGA-3′,下游:5′-TCGCTTGTTCTGGCTGATGT-3′;ERK1上游引物:5′-TCTGCCCTACTCATCCTG-3′,下游:5′-GCCTCCACATCCAATCAC-3′;ERK2上游引物:5′-CTTCCAACCTCCTGCTGAAC-3′,下游:5′-GC-GTGGCTACATACTCTGTC-3′;Bax上游引物:5′-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3′,下游:5′-GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3′;內參GAPDH上游引物:5′-GACCCCTTCATTGACCTCA-3′,下游:5′-TGCTTC-ACCACCTTCTTGA-3′。相對表達量以2-ΔΔCt法表示。

1.5Western印跡檢測各組INS-1細胞中HSP72、p-ERK1/2、ERK1/2、Bax蛋白表達 提取各組INS-1細胞總蛋白,對蛋白濃度定量后,將等量蛋白進行電泳分離并轉膜,用將膜封閉1 h后,分別加入HSP72抗體、p-ERK1/2抗體、ERK1/2抗體、Bax抗體、GAPDH抗體(1∶500),4 ℃孵育過夜,TBST洗滌后室溫下與二抗(1∶5 000)孵育1 h,顯影,對條帶灰度值進行定量分析,目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值的比值為目的蛋白相對表達水平。

1.6統計學方法 采用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析和SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組INS-1細胞凋亡情況 與對照組比較,高糖組INS-1細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與高糖組比較,利拉魯肽低、中、高劑量組INS-1細胞凋亡率均顯著降低(P<0.05);隨著利拉魯肽使用劑量升高,INS-1細胞凋亡率依次顯著降低(P<0.05),見圖1、表1。

表1 各組INS-1細胞凋亡率和HSP72、ERK1、ERK2、Bax mRNA表達水平比較

圖1 各組INS-1細胞凋亡

2.2各組INS-1細胞中HSP72、ERK1、ERK2、Bax mRNA表達 與對照組比較,高糖組INS-1細胞中HSP72、ERK1、ERK2、Bax mRNA表達水平顯著升高(P<0.05);與高糖組比較,利拉魯肽低、中、高劑量組上述指標均顯著降低(P<0.05);隨著利拉魯肽使用劑量升高,INS-1細胞中HSP72、ERK1、ERK2、Bax mRNA表達水平依次顯著降低(P<0.05),見表1。

2.3各組INS-1細胞中HSP72、p-ERK1/2、ERK1/2、Bax蛋白表達 與對照組比較,高糖組INS-1細胞中HSP72、p-ERK1/2/ERK1/2、Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與高糖組比較,利拉魯肽低、中、高劑量組INS-1細胞中HSP72、p-ERK1/2/ERK1/2、Bax蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05);隨著利拉魯肽使用劑量升高,INS-1細胞中HSP72、p-ERK1/2/ERK1/2、Bax蛋白表達水平依次顯著降低(P<0.05),見圖2、表2。

表2 各組INS-1細胞中HSP72、p-ERK1/2、ERK1/2、Bax蛋白表達水平比較

1～5:對照組、高糖組、利拉魯肽低劑量組、利拉普肽中劑量組、利拉魯肽高劑量組

3 討 論

GLP-1在2型糖尿病中發揮重要作用〔14〕。利拉魯肽用于改善糖尿病及其并發癥的報道較多。張麗貞〔15〕研究表明,利拉魯肽與二甲雙胍合用可提高2型糖尿病患者胰島素分泌指數,增強胰島β細胞的分泌能力。樂嶺等〔16〕研究表明,利拉魯肽對高糖作用下人臍靜脈內皮細胞具有保護作用,可能通過胰島素受體底物(IRS)-1/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/內皮型一氧化氮合酶(eNOS)途徑發揮作用。本研究結果提示,高糖可誘導INS-1細胞凋亡;利拉魯肽可呈劑量依賴性降低高糖對INS-1細胞的損傷作用,可能通過減少高糖下的胰島細胞凋亡在治療糖尿病中發揮作用。

HSPs家族是機體重要的內源性保護因子,通過在急性和慢性代謝應激期間提供細胞保護,在細胞穩態中發揮關鍵作用〔17〕。有研究發現,GLP-1可促進高糖條件下兔胸主動脈內皮細胞增殖,并抑制細胞凋亡,降低高糖誘導的HSP70水平〔18〕。HSP72是HSPs家族中最易被應激反應誘導表達的蛋白成員,在急性應激后表達明顯增強。本研究結果提示,HSP72在高糖誘發的應激反應中快速升高,利拉魯肽降低高糖對INS-1細胞的損傷作用后,應激反應減弱,HSP72水平下降。

ERK1/2是介導生長、發育、分裂、死亡等多種細胞生理過程的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的主要成員,參與應激引起的細胞反應〔19〕。Cai等〔20〕研究表明,GLP-1治療可減輕糖尿病視網膜中氧化應激誘導的自噬,這種保護作用可能通過GLP-1R-ERK1/2-HDAC6信號通路發揮作用。本研究結果提示,高糖誘導INS-1細胞凋亡的應激反應中ERK1/2轉錄及磷酸化水平升高,利拉魯肽抑制高糖誘導的INS-1細胞凋亡過程中,ERK1/2轉錄及磷酸化水平隨著應激反應的減弱而降低。

綜上,GLP-1類似物利拉魯肽可以抑制高糖誘導的胰島細胞凋亡反應,并降低HSP72水平及ERK1/2通路的磷酸化水平。但更多作用機制仍有待探究。