基于NLRP3信號通路探究塞來昔布對膝關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞凋亡及神經(jīng)遞質(zhì)的作用機(jī)制

曹磊 李小平 張磊 費(fèi)熙 張勁

(武漢市中醫(yī)院,湖北 武漢 430000)

骨關(guān)節(jié)炎具有臨床多見、進(jìn)展緩慢、不易治愈等特點(diǎn)。膝關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生多與各種因素所造成的慢性退行性膝關(guān)節(jié)病變相關(guān),并可導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨遭到破壞、丟失甚至硬化等多種病理性特征產(chǎn)生,同時(shí)伴隨出現(xiàn)囊性病變進(jìn)而造成骨贅發(fā)生。膝關(guān)節(jié)炎疾病的產(chǎn)生常會伴隨關(guān)節(jié)發(fā)生不同程度的腫脹、疼痛等,同時(shí)其病變范圍還涵蓋了關(guān)節(jié)周圍的肌肉、骨骼、滑膜及韌帶等,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能產(chǎn)生障礙,嚴(yán)重者導(dǎo)致關(guān)節(jié)殘疾、影響患者生活質(zhì)量〔1,2〕。膝關(guān)節(jié)炎在人群中的發(fā)病率非常高,尤其老年人群較多。膝關(guān)節(jié)炎的發(fā)病原因有多種因素,其中包括年齡、性別等有關(guān),膝關(guān)節(jié)炎的發(fā)生還可能與其負(fù)重及過度活動相關(guān)〔3,4〕。

目前關(guān)于膝關(guān)節(jié)炎的治療主要是使用非甾體抗炎藥膏劑、貼劑等局部涂抹用藥,可以減輕膝關(guān)節(jié)的疼痛〔5,6〕。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NLRP)3信號通路中的NLRP3炎性小體介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可以對抗外病原性微生物,維持自身穩(wěn)定〔7〕。滑膜細(xì)胞在疾病進(jìn)程中具有較為關(guān)鍵的作用,不僅可在一定程度上釋放細(xì)胞因子并使腫瘤樣細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性活化,同時(shí)其發(fā)生的凋亡缺陷也是造成免疫性關(guān)節(jié)炎疾病進(jìn)程的關(guān)鍵病理機(jī)制。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括兒茶酚胺和5-羥色胺兩大類,參與疼痛痛的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)過程。塞來昔布作為環(huán)氧合酶(COX)-2的特異性抑制劑,可在一定程度上對炎性前列腺物質(zhì)合成產(chǎn)生一定的抑制效用,進(jìn)而起到消炎、止痛的效果,且不良反應(yīng)較小并在治療中的應(yīng)用效果較好〔8〕,但其具體作用機(jī)制尚不明確。本文探討基于NLRP3信號通路來探究塞來昔布對膝關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞凋亡及神經(jīng)遞質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1動物材料 45只SD大鼠購買于上海代軒生物科技公司〔合格證書為:SCXK(滬)2019-0038〕,體質(zhì)量200～220 g,溫度(24±1)℃,大鼠單籠喂養(yǎng),濕度45%～50%,大鼠活動飲水自由,給予大鼠1 w時(shí)間習(xí)慣新環(huán)境,按照《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物、儀器與試劑 痹祺膠囊(國藥準(zhǔn)字Z10910026,規(guī)格:0.3 g/粒)天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司;塞來昔布(國藥準(zhǔn)字J20140072,規(guī)格:200 mg/粒)輝瑞制藥有限公司;木瓜蛋白酶來自江西江藍(lán)純生物試劑公司;酶聯(lián)免疫試劑盒來自上海延慕有限公司;蘇木素-伊紅(HE)染色來自北京雷根生物公司;蛋白電泳儀來自北京德元國際科技;一抗、二抗均來自上海歌凡生物科技有限公司。

1.3建模和分組 45只大鼠中隨機(jī)選取35只建模:無菌條件下用10 ml生理鹽水與木瓜蛋白酶0.4 g,L-半胱氨酸36 mg同時(shí)混勻后冷藏儲存,在建模前30 min常溫靜置。將大鼠仰臥位固定于木板上,3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔麻醉后脫毛并消毒,左右膝關(guān)節(jié)屈曲45 °,以髕骨下級髕腱外緣為進(jìn)針點(diǎn),用1 ml注射器向髁間窩方向進(jìn)針,抵達(dá)股骨髁后回撤2 mm,注入混合液0.15 ml,建立關(guān)節(jié)炎模型。干預(yù)4 w后,4組均隨機(jī)抽取3只大鼠HE染色,與正常組比較,觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)變化以判斷造模是否成功〔9〕,實(shí)驗(yàn)過程建模失敗3只,2只死亡。最終分組分為正常組、膝關(guān)節(jié)炎組、塞來昔布組(塞來組)、痹祺膠囊對照組(痹祺組),每組10只。

1.4干預(yù)方法 建模后,塞來組給予塞來昔布4 mg/kg灌胃,痹祺組給予痹祺膠囊0.6 g/kg灌胃,上述藥物均1次/d,各組治療8 w后停止給藥,正常組和膝關(guān)節(jié)炎組干預(yù)給予同體積的生理鹽水。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測 大鼠血液中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NLRP)3水平大鼠腹主動脈取血置于抗凝管中,4 ℃以轉(zhuǎn)速為1 000 r/min離心15 min,留取上層血清于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎肊LISA測定各組大鼠血清中 TNF-α、IL-1β、NLRP3的水平。

1.6滑膜組織HE染色 采血后,用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,處死,取滑膜組織,置于4%多聚甲醛液固定24 h,取出已經(jīng)固定好的椎間盤組織,脫水,甲苯透明,浸蠟包埋、切片取4 μm厚度,用二甲苯脫蠟,水化,水洗5 min,置于蘇木素染色10 min,水洗,再次染色,脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。光鏡下觀察滑膜組織變化。

1.7Western印跡檢測大鼠滑膜組織中TNF-α、IL-1β、NLRP3表達(dá) 取出滑膜組織稱重,于冰上剪碎組織后加入裂解液(每100 mg組織加入800 μl裂解液),冰盒中裂解約30 min,期間每10 min振蕩1次,使其充分裂解,12 000 r/min離心15 min,吸取上清即為蛋白樣品。蛋白樣品,上樣加緩沖液,煮沸15 min。冷卻后上樣(25 μl/孔),凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,封閉液封閉1 h,一抗TNF-α(1∶1 000)、IL-1β(1∶500)、NLRP3(1∶500)4 ℃孵育過夜,洗滌3次,每次15 min。室溫?fù)u床孵育二抗(1∶3 000)1 h,洗滌3次,每次15 min。電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影,以GAPDH作為內(nèi)參,計(jì)算與GAPDH比值求得TNF-α、IL-1β、NLRP3蛋白相對表達(dá)含量。

1.8滑膜細(xì)胞提取 采用組織貼壁培養(yǎng)法分離滑膜細(xì)胞,進(jìn)行培養(yǎng),先取滑膜組織,剪碎滑膜組織切成約1 mm×1 mm的小塊,放在含0.25%Ⅱ型膠原酶的培養(yǎng)皿中進(jìn)行消化3 h,混勻細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心,離心時(shí)間10 min,棄上清液,培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)重懸細(xì)胞,添加20%胎牛血清,培養(yǎng)箱中培育。待細(xì)胞貼壁后,隔日更換1次培養(yǎng)基,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長。若裂解細(xì)胞數(shù)達(dá)到80%時(shí),按1∶3的比例進(jìn)行傳代。

1.9TUNEL各組滑膜細(xì)胞凋亡 收集滑膜細(xì)胞,嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說明進(jìn)行操作,加入5 μl膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和5 μl碘化丙啶(PI)染料后將其混勻并過濾,室溫避光孵育30 min,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,5 min/次,加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光孵育5 min,PBST清洗,吸干液體后封片并在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野,觀察采集圖像。

1.10ELISA大鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(HT)檢測 滑膜組織取出后,低溫下取下丘腦,生理鹽水清洗后用濾紙吸干〔16〕。使用天平稱取腦組織重量,在加入1 ml生理鹽水的EP管中將組織放入其中制備組織均勻漿,3 000 r/min離心15 min,取上清液,采用ELISA檢測NE、DA、5-HT含量。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組血清中炎性因子水平檢測 與正常組相比,痹祺組、塞來組、膝關(guān)節(jié)炎組TNF-α、IL-1β水平明顯升高(P<0.05);與膝關(guān)節(jié)炎組相比,痹祺組和塞來組TNF-α、IL-1β水平明顯降低(P<0.05);與痹祺組相比,塞來組TNF-α、IL-1β水平明顯降低(P<0.05),見表1。

表1 各組血清中炎性因子水平

2.2各組滑膜組織HE染色結(jié)果 正常組膝關(guān)節(jié)形態(tài)良好,無明顯損傷。膝關(guān)節(jié)炎組關(guān)節(jié)軟骨表面損傷嚴(yán)重,并伴隨軟骨細(xì)胞排列紊亂、層次模糊、潮線缺失,伴隨大量炎癥細(xì)胞浸潤。痹祺組膝關(guān)節(jié)軟骨表面較整齊,細(xì)胞形態(tài)仍伴隨一定程度紊亂,軟骨層仍有模糊及潮線缺損現(xiàn)象,且部分區(qū)域仍伴隨軟骨細(xì)胞缺失及部分空軟骨陷窩。塞來組膝關(guān)節(jié)軟骨表面趨于平整且細(xì)胞排列部分整齊,軟骨層次逐漸清晰,潮線趨于完整,見圖1。

圖1 各組滑膜組織(HE染色,×200)

2.3各組滑膜組織中TNF-α、NLRP3、IL-1β表達(dá) 與正常組相比,膝關(guān)節(jié)炎組、痹祺組、塞來組TNF-α、IL-1β、NLRP3表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與膝關(guān)節(jié)炎組相比,痹祺組和塞來組TNF-α、IL-1β、NLRP3表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與痹祺組相比,塞來組TNF-α、NLRP3、IL-1β表達(dá)明顯降低(P<0.05),見表2,圖2。

圖2 各組滑膜組織中TNF-α、IL-1β、NLRP3表達(dá)

表2 各組滑膜組織中TNF-α、NLRP3、IL-1β表達(dá)比較

2.4各組滑膜細(xì)胞凋亡情況 與正常組〔(4.32±1.35)%〕比較,膝關(guān)節(jié)炎組滑膜細(xì)胞凋亡率〔(5.01±0.71)%〕無明顯變化(P>0.05);與膝關(guān)節(jié)炎組比較,痹祺組〔(50.46±5.44)%〕和塞來組滑膜細(xì)胞凋亡率〔(74.47±2.40)%〕明顯升高(P<0.05);與痹祺組相比,塞來組滑膜細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05),見圖3。

圖3 各組滑膜細(xì)胞凋亡(TUNEL染色,×200)

2.5各組腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá) 與正常組相比,膝關(guān)節(jié)炎組、痹祺組、塞來組NE、DA、5-HT水平明顯升高(P<0.05);與膝關(guān)節(jié)炎組相比,痹祺組和塞來組NE、DA、5-HT水平明顯降低(P<0.05);與痹祺組相比,塞來組NE、DA、5-HT水平明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)

3 討 論

關(guān)節(jié)炎疾病產(chǎn)生的機(jī)制與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成、降解等的失衡重要相關(guān),同時(shí),由于外界刺激導(dǎo)致軟骨表面被侵蝕、變薄及其彈性特性損失均是影響疾病發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素之一,但其具體的發(fā)病機(jī)制仍需進(jìn)一步明確〔10,11〕。在已經(jīng)超過65歲的人群中,骨關(guān)節(jié)炎具有極高的發(fā)病率,約占70%;而且隨著人口老齡化的加重和人均壽命的延長,膝關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率將進(jìn)一步升高〔12,13〕。

膝關(guān)節(jié)炎發(fā)生時(shí),滑膜組織中出現(xiàn)大量固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞及他們分泌的炎性因子,引起滑膜組織的炎性增生,繼而造成軟骨組織損傷。且有相關(guān)研究顯示,膝關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生可能與NLRP3的異常表達(dá)存在一定聯(lián)系〔14〕。NLRP3是NLRP 蛋白家族中的典型代表之一,大量刺激物可以激活NLRP3炎癥小體,包括多種微生物產(chǎn)物、內(nèi)源性分子或顆粒物質(zhì)等。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為膝關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制由關(guān)節(jié)的慢性炎癥驅(qū)動,導(dǎo)致關(guān)節(jié)的不可逆破壞。在參與膝關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的幾種細(xì)胞因子中,IL-1β是從單核細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子之一,用于誘導(dǎo)和延續(xù)關(guān)節(jié)中的慢性炎癥過程〔15〕。塞來昔布具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用。有學(xué)者通過對126例膝關(guān)節(jié)患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過口服塞來昔布干預(yù)后,患者的臨床癥狀評分顯著降低,炎性因子TNF-α、IL-6水平降低。說明塞來昔布在治療中可通過抑制炎癥釋放進(jìn)而降低疼痛反應(yīng)并改善關(guān)節(jié)功能〔16〕。

邱星罡等〔17〕通過對76例膝關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過雙醋瑞因膠囊聯(lián)合塞來昔布干預(yù)后,患者的疼痛痛緩解,TNF-α、IL-1水平下降,對膝關(guān)節(jié)炎有較好的抗炎作用。IL-1和TNF-α作為與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子可參與關(guān)節(jié)炎疾病的進(jìn)程,且有研究發(fā)現(xiàn)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織中NLRP3炎癥小體表達(dá)明顯升高,小干擾RNA沉默NLRP3能夠下調(diào)NLRP3的表達(dá),并且抑制炎癥因子 IL-Iβ等的分泌〔18,19〕。本研究說明塞來昔布有很好的抗炎作用,并且可能通過調(diào)控NLRP3信號通路有關(guān),本文與上述研究一致。

關(guān)節(jié)炎中發(fā)生細(xì)胞凋亡能夠在一定程度上造成滑膜組織異常增生,由于關(guān)節(jié)炎患者的滑膜細(xì)胞存在異常凋亡過程不僅和凋亡基因表達(dá)異常有關(guān),還和很多分子對凋亡調(diào)節(jié)作用有關(guān)。有研究〔20〕發(fā)現(xiàn)針灸可以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜炎大鼠滑膜細(xì)胞的凋亡,可以抑制滑膜炎、阻止對骨質(zhì)的侵襲,減輕關(guān)節(jié)炎腫脹,有利于關(guān)節(jié)炎的恢復(fù)。滑膜細(xì)胞與關(guān)節(jié)疾病的產(chǎn)生機(jī)制具有一定相關(guān)性,其異常凋亡和增殖均會影響關(guān)節(jié)疾病的進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)塞來昔布能夠抑制NLRP3信號通路,降低滑膜-軟骨微環(huán)境中的NLRP3炎性小體的表達(dá),增加滑膜細(xì)胞的凋亡,可能是塞來昔布抑制滑膜炎癥、阻滯軟骨基質(zhì)降解,促進(jìn)軟骨細(xì)胞的功能恢復(fù),進(jìn)而治療膝關(guān)節(jié)炎〔21〕。袁佳沁等〔22〕研究通過選取培養(yǎng)傳達(dá)滑膜細(xì)胞,建立關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型,經(jīng)過藥物清熱利濕通絡(luò)方劑干預(yù)后發(fā)現(xiàn),滑膜細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多,使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯,同時(shí)炎性因子水平也明顯下降,說明滑膜細(xì)胞凋亡增多,進(jìn)而改善炎癥,減少關(guān)節(jié)損害。本研究說明塞來昔布可以增加滑膜細(xì)胞凋亡,可能和抑制NLRP3信號通路有關(guān),對膝關(guān)節(jié)炎治療有一定益處。

下丘腦-垂體-腎上腺素皮質(zhì)軸作為關(guān)鍵的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng),可在受到刺激時(shí)被異常激活,并可通過適應(yīng)內(nèi)環(huán)境變化穩(wěn)定機(jī)體的動態(tài)平衡。而5-HT作為關(guān)鍵的活性物質(zhì),在疾病發(fā)生時(shí)候會各類釋放大量炎癥介質(zhì),其中就包括5-HT。膝關(guān)節(jié)炎發(fā)生時(shí),炎癥局部血小板被激活,釋放5-HT、DA、NE。研究證實(shí),經(jīng)過塞來昔布干預(yù)后,患者血清中的5-HT、DA含量明顯下降,改善患者疼痛介質(zhì)水平,說明塞來昔布對治療膝關(guān)節(jié)炎有較好的效果〔15〕。本研究證實(shí)塞來昔布能夠減移植神經(jīng)遞質(zhì)傳遞而減少疼痛反應(yīng)。

綜上,塞來昔布治療膝關(guān)節(jié)炎大鼠效果顯著,可以促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡,降低滑膜組織炎性表達(dá)及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平,其作用機(jī)制可能與調(diào)控NLRP3信號通路有關(guān),關(guān)于塞來昔布對NLRP3炎癥小體的相關(guān)研究較少,希望本文可以為膝關(guān)節(jié)炎的研究提供新思路。