AngⅡ/NLRP3炎性小體信號通路介導高血壓大鼠血管老化的機制

周麗娟 劉美霞 劉劍剛 石丹丹

(1中國中醫科學院,北京 100700;中國中醫科學院 2西苑醫院;3老年病研究所)

血管老化(VA)主要表現為血管功能和結構的改變,是多種血管疾病的基礎,可影響血管相關疾病的閾值、過程和嚴重程度〔1〕。臨床上VA與高血壓(HTN)關系密切,血壓與血管功能及結構之間的相互作用較復雜,血壓升高本身促進加速VA,血壓同時也可能是VA的后果〔2〕,但具體作用機制目前尚不明確。血管緊張素(Ang)Ⅱ是最具血管活性的肽,是所有血管的有力收縮劑〔3〕,研究表明,AngⅡ信號級聯的促炎特征在動脈逆老化重構過程中發揮著主導作用〔4〕,同時炎癥參與了AngⅡ誘導的HTN和血管功能障礙〔5〕,而核苷酸結合寡聚結構域樣受體蛋白(NLRP)3作為炎性小體家族重要成員,NLRP3炎性小體的激活還可促進內皮祖細胞衰老并引起血管新生和內皮修復能力降低〔6〕。因此本研究擬從AngⅡ/NLRP3炎性小體入手,探討HTN大鼠血管老化發生進展的機制及其影響程度。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠,3周齡;SPF級雄性相同遺傳背景的WKY/NCrl大鼠〔自發性高血壓大鼠(SHR)對照品系〕,11周齡;SPF級雄性SHR/NCrl大鼠,11周齡;以上動物均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物合格證號:SCXK(京)2016-0006。動物飼養于本院的屏障級動物室,室溫控制22～26 ℃,濕度控制50%～70%,動物自由攝水和飲食,適應性喂養1 w。

1.2實驗試劑及儀器 AngⅡ抗體,批號:ab97381;NLRP3抗體,批號:ab214185;平滑肌(SM)22α抗體,批號ab14106;基質金屬蛋白酶(MMP)-9抗體,批號:ab38898;三磷酸腺苷(ATP)鈣離子轉運蛋白抗體,批號:ab3530;以上抗體均由Abcam(英國)公司生產。MMP抑制劑(TIMP)-1抗體,批號:PA5-47778,由Thermo Fisher Scientific(美國)/Invitrogen生命技術有限公司生產。以上抗體均由北京欣博盛生物科技有限公司提供。BP-98A型,Softron大鼠智能血壓計,北京軟隆科技有限責任公司生產。RM-2245型石蠟切片機、ASP-200S型脫水機、EG1150型病理包埋機,均由Leica(德國)公司生產。Fresco型低溫冷凍離心機、MultiSkan3型酶標儀,購自Thermo(美國)公司。

1.3血壓的測量 大鼠適應性飼養7 d后,實驗開始的第1周下午14∶00開始測量清醒狀態下的大鼠血壓。持續5 d將大鼠限制在鼠筒中10～20 min,再采用尾袖法測量血壓。血壓計算公式:平均動脈血壓=舒張壓+0.412(收縮壓-舒張壓)。

1.4動物分組 實驗動物分為4周齡的Wistar正常模型組(Wistar對照組),12周齡的WKY/SHR同品系對照組(WKY對照組),12周齡的SHR模型組(SHR模型組),每組10只。正常飼料喂食,觀察一般情況,每兩周稱量體質量和檢測血壓,持續8 w,實驗前空腹,2%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射后進行取材。

1.5組織取材 隨機數字表法從每組選取5只大鼠開胸,分離胸主動脈及主動脈弓,并各剪下動脈血管約1 cm置于4%多聚甲醛溶液中固定進行蘇木素-伊紅(HE)染色和Masson染色,其中5只大鼠的主動脈錫紙包裝并進行液氮凍存,以備Weston印跡檢測,另5只大鼠的主動脈勻漿檢測鈣離子(Ca2+)/鎂離子(Mg2+) ATP及鈉離子(Na+)/鉀離子(K+) ATP的酶活性。

1.6主動脈的病理觀察及檢測 將固定后的血管組織經過脫水、透明、浸埋、切片、脫蠟、水化等,進行HE染色,Masson染色,封片,備用于顯微鏡下觀察,Masson染色后并用圖像處理系統測量膠原纖維的灰度值。

1.7Ca2+/Mg2+ATP及Na+/K+ATP酶活性檢測 采用比色法進行,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.8Western印跡法檢測 取凍存的大鼠血管組織,冰上操作,加入0.1 mol/L苯甲基磺氟(PMSF)的RIPA裂解液,超聲勻漿后,4 ℃離心,13 000 r/min,20 min。取上清液進行蛋白濃度測定〔二喹啉甲酸(BCA)法〕。濕轉法轉移到NC膜上,3%牛血清白蛋白(BSA)-Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)輕搖30 min,分別加入β-actin鼠單抗,AngⅡ(1∶20 000稀釋),NLRP3(1∶2 000稀釋),SM22α(1∶5 000稀釋),MMP-9(1∶10 000稀釋),質膜Ca2+-ATP酶(PMCA)3(1∶1 000稀釋),TIMP-1(1∶500稀釋),室溫孵育10 min,放4 ℃過夜。次日取出,室溫孵育30 min,TBST洗膜5次,5%脫脂奶粉-TBST稀釋,進行二抗孵育,山羊抗小鼠IgG(H+L)辣根過氧化酶(HRP),1∶10 000,室溫輕搖40 min,TBST洗膜6次,電化學發光(ECL)法顯影。以β-actin為內參,分析各條帶的相對灰度值。

1.9統計學方法 采用SPSS23.0軟件,若滿足正態分布且方差齊,采用單因素方差分析(ANOVA檢驗),若不滿足正態分布或方差不齊,采用非參數檢驗。

2 結 果

2.1各組血壓檢測 與Wistar對照組及WKY對照組比較,SHR模型組初始收縮壓及處理時收縮壓均顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 各組收縮壓比較

2.2各組胸主動脈及主動脈弓病理形態比較 鏡下顯示,Wistar對照組胸主動脈及主動脈弓內膜較薄,中膜平滑肌細胞排列規則,外膜結構清晰;WKY對照組胸主動脈及主動脈弓內膜面較平整,未見明顯隆起,與中膜連接較緊密,中膜平滑肌細胞排列較整齊,各彈力纖維層排列有序,外膜結構較清晰;SHR模型組胸主動脈及主動脈弓內膜面皺縮,可見明顯隆起,與中膜連接不緊密,中膜明顯增厚,平滑肌細胞層增多、細胞排列紊亂,各彈力纖維層嚴重扭曲增厚,外膜結構不清晰。見圖1。

圖1 各組主動脈及主動脈弓(×200)

2.3各組主動脈、主動脈弓纖維及炎性病理染色比較 Masson染色后圖像顯示:與Wistar對照組及WKY對照組主動脈比較,SHR模型組主動脈膠原相對含量顯著升高(P<0.01)。與Wistar對照組及WKY對照組比較,SHR模型組主動脈弓膠原相對含量顯著升高(P<0.01)。見圖1、表2。

表2 各組主動脈及主動脈弓膠原光密度比值、Ca2+/Mg2+及Na+/K+ ATP酶活性

2.4各組胸主動脈Ca2+/Mg2+及Na+/K+ATP酶活性比較 與Wistar對照組及WKY對照組比較,SHR模型組Ca2+/Mg2+ATP酶活性顯著降低(P<0.01),見表2。

2.5各組胸主動脈相關蛋白的表達比較 與Wistar對照組比較,WKY對照組及SHR模型組主動脈AngⅡ、NLRP3、MMP-9、TIMP-1蛋白顯著增多,SM22α表達顯著降低(P<0.05,P<0.01)。與WKY對照組比較,SHR模型組主動脈AngⅡ、NLRP3、MMP-9蛋白顯著增多,SM22α表達顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見圖2、表3。

圖2 Western印跡檢測各組胸主動脈相關蛋白表達

表3 各組胸主動脈相關蛋白表達

3 討 論

VA并不完全等同于動脈硬化,動脈硬化患者可合并VA,但VA可發生于無硬化的動脈。VA一般分為生理性VA和病理性VA。由增齡所引起的機體自然衰老屬于生理性VA,不可避免〔7〕。但由于各種疾病如HTN等所引起的血管出現一系列病理性改變,VA表現大多與患者實際年齡不相符,這就屬于病理性VA。病理性VA以血管退行性變化為主要臨床表現,血管壁成分改變,具體為血管僵硬度增加、順應性降低和動脈管壁增厚等血管功能和結構的改變,其血管損害較生理性VA更為復雜和嚴重〔1〕。臨床上HTN與VA的發生發展密切相關,且二者常常相互作用,互為因果,但具體作用機制復雜尚不明確。SHR/NCrl大鼠是1963年日本京都大學醫學院Okamoto實驗室利用有顯著HTN癥狀的遠交(封閉群)Wistar Kyoto雄性大鼠和帶有輕微HTN癥狀的雌性大鼠交配而來,并從所得的F1代開始進行近交篩選,最終形成了所有雄性和雌性自發HTN發生率100%的近交系SHR。1969年,美國國立衛生研究院引進了SHR〔8〕。WKY/NCrl大鼠品系是1971年NIH從Kyoto醫學院引入的Wistar種群中培育的品系,作為SHR大鼠的對照組,即Wistar Kyoto(WKY)大鼠。SHR大鼠為基因性HTN,腎臟的改變在自發性HTN中發揮關鍵作用,SHR腎臟的決定作用與人類的原發性HTN很相似〔9〕。本實驗成功構建HTN模型大鼠。Ca2+/Mg2+ATP酶和Na+/K+ATP酶是兩種ATP水解酶,它們以能量依賴方式維持細胞內的電化學梯度,是信號轉導所必需的。Ca2+信號的嚴格調控對細胞功能和存活至關重要,質膜Ca2+-ATP酶(PMCAs)是機體Ca2+穩態和局部細胞內Ca2+動力學的關鍵調節因子,在調節所有真核細胞的細胞Ca2+穩態中起著至關重要的作用〔10〕。在靜息狀態的細胞中,細胞內鈣濃度可以通過ATP酶的作用將鈣儲存在細胞內儲備中,通過質膜結合的鈣ATP酶擠壓鈣,或通過Na+/Ca2+交換來維持。同時Na+/K+-ATP酶活性有助于細胞的靜息膜電位,并在刺激活動爆發后將Na+和K+濃度恢復到靜息膜水平〔11〕。本實驗結果說明,Na+/K+及Ca2+/Mg2+ATP酶在血管組織中活性的降低可能導致或加重VA和HTN的發生發展。血管壁主要是由血管內膜、中膜和外膜構成的,維持血管健康需要血管壁各組成部分的相互作用〔12〕。本實驗結果提示,HTN能夠誘發及加劇大鼠主動脈形態學發生改變,并通過增加動脈膠原相對含量、降低動脈順應性導致血管壁結構出現一系列病理變化,進而誘發及加速VA的發生發展。AngⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統中的主要活性物質,AngⅡ的異常增高參與了HTN等疾病的病理進程〔13〕。同時,AngⅡ通過觸發一系列信號轉導級聯,誘導血管平滑肌細胞(VSMCs)的炎癥,遷移,增殖,細胞外基質(ECM)合成,使細胞從收縮型轉變為合成型,參與VA的病理進程,其中AngⅡ相關的炎性信號級聯是引起VA的關鍵機制〔14,15〕。并且有研究表明NLRP3炎性小體與VSMCs細胞表型轉變、彈性蛋白斷裂、膠原增生、鈣化等密切相關,NLRP3基因敲除能減弱AngⅡ誘導的VSMCs表型轉化,改善血管重構〔16,17〕。VSMCs的表型轉化過程同時伴有許多功能性改變,VSMCs發生大量增殖和遷移,這成為心血管系統生理和病理的重要基礎,也是VA的一大關鍵環節。增殖肥大的平滑肌及間質構成血管內膜的增厚,VSMCs遷移至內膜下,并大量合成釋放多種基質,包括MMP-9、AngⅡ、炎性因子等活性物質,進一步誘導并促進內皮細胞功能失調、血管的炎性改變及血管重塑〔18,19〕。本實驗結果表明,AngⅡ的異常升高、NLRP3炎性小體的激活,進一步誘導VSMCs炎癥、遷移、增殖、表型轉化SM22α表達減少及ECM合成,MMP-9增多,介導HTN及VA病理過程。

綜上,隨著年齡增長,VA程度逐漸加重。HTN可導致血管結構改變,血管重塑,進而影響血管功能,誘發并加劇VA。其機制可能與AngⅡ表達的增多,導致NLRP3炎性小體被激活,進一步誘導VSMCs炎癥、遷移、增殖相關,并進一步導致表型轉化SM22α表達的減少,ECM合成MMP-9增多及調控細胞內Ca2+穩態的Ca2+/Mg2+ATP酶活性降低。