微小RNA-424-5P靶向調控HMGA1基因對胃癌細胞生長、侵襲的影響

王嬋 初麗敏 王燕云

(石家莊市第三醫院,河北 石家莊 050000)

胃癌是一種常見的癌癥,臨床上雖然其診斷和治療策略得到改善,但是晚期胃癌患者的預后仍然很差〔1〕。對胃癌發生和轉移的致病機制及臨床治療進行探索和闡明具有積極意義。微小RNA(miR)是一類內源性、長度在18～22 nt的非編碼RNA,能夠在轉錄后對基因表達進行調節,在生物學過程中發揮關鍵性作用〔2〕。目前已有充分證據表明miR能夠對細胞周期、增殖、凋亡和遷移產生影響,進而導致多種腫瘤或者疾病的發生和發展,對miR深入研究和理解其調節機制及改善胃癌的治療具有重要的意義〔3〕。相對于癌旁正常組織,miR-451在胃癌組織中表達較低,且低表達患者的生存期較短,可作為胃癌患者的預后標志物〔4〕,miR-203a-3P和miR-99b-5P能夠靶向胰島素樣生長因子(IGF)-1R進而阻止胃癌的發生和發展〔5〕。研究表明miR-424-5P在多種惡性腫瘤中均存在異常表達,例如肝癌、乳腺癌和結直腸癌等〔6〕。miR-424-5P在胃癌組織中有較高表達,表明miR-424-5P能夠參與胃癌的調節,但是其潛在機制還未明確。本文通過體外研究探討miR-424-5P對胃癌細胞的影響及其分子機制。

1 資料與方法

1.1材料 人胃癌細胞株BGC-823細胞(ATCC),脂質體轉染實際(Lipofectamine 2000,美國Invitrogen),miR-424-5P inhibitor、miR-424-5P mimics和陰性對照購自廣州銳博有限公司,RNA提取試劑盒購自北京康為有限公司,SYBR Green qPCR Master Mix 檢測試劑盒和反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司,Transwell小室和DMEM培養基購自美國Coring公司,胎牛血清和胰蛋白酶購自杭州四季青有限公司,四甲基噻唑藍(MTT)購自美國Sigma公司,二甲基亞砜(DMSO)購自北京鼎國有限公司,高遷移率族蛋白(HMG)A1報告基因載體構建購自上海吉瑪有限公司,雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司,基質膠購自美國BD公司,電化學發光(ECL)、細胞裂解液和二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天有限公司,辣根過氧化物酶標記的二抗、SOX7抗體和GAPDH抗體購自美國Abcam公司。

1.2細胞培養 將人胃癌BGC-823細胞復蘇后,應用10%胎牛血清,在5%二氧化碳和37 ℃培養箱中進行培養,每1～2 d更換新鮮的培養基,細胞數量鋪滿瓶底80%以上時進行傳代。將對數期生長細胞接種至96孔板中,培養箱培養12 h待細胞貼壁生長后用Lipofectamine 2000進行轉染,應用miR-424-5P抑制物(inhibitor)轉染的BGC-823細胞列為anti-miR-424-5P組。應用Mimic作為陰性對照進行轉染的BGC-823細胞組標記為anti-NC組,不進行轉染的BGC-823細胞列為對照組,細胞轉染后各組繼續在培養箱中培養。

1.3qRT-聚合酶鏈反應(PCR)檢測 將細胞培養48 h后收集各組BGC-823細胞,應用RNA提取試劑盒將細胞內總RNA提取,應用分光光度計對RNA純度和濃度進行檢測,應用合格的RNA以逆轉錄試劑盒合成cDNA并以其為模板,參考SYBR GreenqPCR Master Mix檢測試劑盒說明書進行PCR擴增,反應體系包括cDNA 2 μl,2×SYBR Green 10 μl,ddH2O 6 μl及上下游引物各1 μl。反應條件為94 ℃反應5 min,然后再94 ℃反應30 s,58 ℃反應20 s,72 ℃反應20 s,共反應40個循環,結束后生產Ct值,應用2-ΔΔCt法對各組miR-424-5P的相對表達水平進行計算,將U6作為內標,實驗重復3次。

1.4MTT研究 將對數期生長的BGC-823細胞接種到96孔板中,參考1.2方法對細胞進行轉染和分組,細胞轉染24、48和72 h后,應用MTT實驗對細胞增殖能力進行檢測,在各個時間點每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT,在培養箱內孵化4 h,傾倒上次培養液,加入150 μl DMSO,在震蕩儀上震蕩10 min,待沉淀溶解后,應用酶標儀在450 nm波長下測定光密度值,實驗重復3次,取均值。

1.5劃痕實驗 在6孔板背面均勻畫直線,每孔至少穿過5條線。將BGC-823細胞接種到6孔板中,培養形成單層細胞,應用滅菌槍頭在單層細胞上垂直畫直線。應用PBS洗滌細胞3次,然后加入不含血清的培養基,然后在培養箱中培養48 h,在顯微鏡(200倍)下測量細胞遷移距離。

1.6Transwell研究 應用50～100 μl基質膠包被的Transwell小室的基底膜,在4 ℃條件下風干,收集各組BGC-823細胞,應用無血清DMEM培養基對細胞進行重懸,將細胞濃度調整為2×105/ml,在小室中加入200 μl細胞懸液,下室中加入600 μl放入10%胎牛血清的DMEM培養液,在培養箱中培養24～48 h,取出小室,用棉簽擦除上室細胞,用多聚甲醛固定液固定30 min,去除固定液,在室溫下風干,用0.1%結晶紫染色液染色20 min,在顯微鏡下隨機選擇5個視野拍照,對穿膜細胞數進行計算,實驗重復3次。

1.7免疫印跡實驗 對轉染48 h后各組BGC-823細胞進行收集,加入200 μl細胞裂解液,在冰上進行為期30 min裂解并提取細胞中的總蛋白,應用BCA蛋白濃度試劑盒對蛋白濃度進行檢測,選擇40 μg變性蛋白樣品進行葡聚糖凝膠電泳對蛋白分離,將其轉印至硝酸纖維膜上,在5%脫脂奶粉中進行2 h封阻,取出膜等滲鹽緩沖液(TBST)進行3次洗膜,然后加入1∶3 000稀釋的二抗,在室溫下孵育2 h,應用TBST洗膜3次,加入ECL化學發光液,在暗室中進行曝光,應用凝膠成像系統對膠片進行掃描,然后應用ImageJ進行分析,以GAPDH作為內參,對各組HMGA1蛋白相對表達水平進行檢測。

1.8數據分析 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗及多組間單因素方差分析。

2 結 果

2.1轉染miR-424-5P inhibitor對胃癌細胞miR-425-5P的表達影響 anti-miR-424-5P組miR-424-5P的相對表達量明顯低于對照組和anti-NC組(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞miR-424-5P表達水平、敲低miR-424-5P對胃癌BGC-823細胞增殖、遷移侵襲能力的影響及miR-424-5P與HMGA1靶向調控關系

2.2胃癌細胞miR-424-5P敲低對其增殖能力影響 BGC-823細胞轉染48 h后,anti-miR-424-5P組OD值顯著低于anti-NC組和對照組(P<0.05)。見表1。

2.3敲低miR-424-5P 對胃癌BGC-823細胞遷移能力的影響 與anti-NC組和對照組比較,anti-miR-424-5P組遷移距離顯著較低(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 3組細胞遷移劃痕實驗結果(×200)

2.4敲低miR-424-5P對胃癌細胞侵襲能力影響 與anti-NC組和對照組比較,anti-miR-424-5P組BGC-823細胞的侵襲細胞數顯著較少(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 3組胃癌細胞侵襲能力(結晶紫染色,×100)

2.53組HMGA1蛋白表達與對照組和anti-NC組比較,anti-miR-424-5P組細胞HMGA1蛋白表達水平顯著較高(P<0.05)。見表1、圖3。

圖3 3組HMGA1表達

3 討 論

胃癌的發生及進展涉及異常細胞增殖、侵襲、凋亡和轉移的多步驟和多因素過程,miR在調節腫瘤細胞生物學過程中有相對重要的作用〔7〕。miR在多種惡性腫瘤的發生和發展過程中發揮關鍵作用,其中一些miR認為是腫瘤抑制基因,另一些被認為是致癌基因。miR的異常表達能夠通過對靶基因抑制參與腫瘤的侵襲和增殖〔8〕。所以鑒定參與腫瘤轉移和發生的特定miR及其靶標對腫瘤的診斷、治療和預防有重要意義〔9〕。

miR-424-5P作為一種新發現的與惡性腫瘤有密切關系的miRNAs生物分子,在多種惡性腫瘤中有異常表達且發揮不同的生物學功能〔10〕。研究發現miR-424-5P在食管鱗狀細胞癌組織及細胞系中均表達降低,其通過靶向抑制SMAD7信號通路所介導上皮間質轉化過程進而對腫瘤細胞的轉移和侵襲進行抑制〔11〕。研究表明基底乳腺癌中miR-424-5P對雙腎上腺皮質激素樣激酶(DCLK)1產生靶向作用,對乳腺癌細胞的侵襲、遷移及增殖產生抑制作用,同時發揮抑癌作用〔12〕。也有研究表明,miR-424-5P在肝癌組織中表達較低,能夠通過對YES關聯蛋白(YAP)1產生抑制,進而削弱肝癌細胞增殖,誘導細胞凋亡〔13〕。研究表明,miR-424-5P在胃癌組織和細胞中呈現高表達形式〔14〕,但是miR-424-5P在胃癌中發揮的功能及其潛在的機制還有待研究〔15〕。本研究發現在胃癌細胞中敲低miR-424-5P水平能夠明顯抑制細胞增殖、遷移和侵襲。

HMGA1能夠調節多個轉錄因子,作為癌基因在腫瘤的發生和發展過程中發揮重要的作用,在正常人中一般為表達缺失和低表達,在癌癥患者中經常出現過度表達〔16〕,前期研究表明,HMGA1過度表達和膀胱癌患者預后、復發、腫瘤分期和等級有密切關系,對HMGA1表達降低能夠降低細胞活性,阻滯細胞周期〔17〕。研究表明HMGA1能夠通過Wnt/β-連環素(catenin)信號通路參與宮頸癌的發展。HMGA基因相關的miR在垂體腺瘤重表達有所下調,從而造成患者HMGA1和HMGA2表達上調,但是在無功能的垂體腺瘤中,下調miR和HMGA1表達上調無關,表明靶向HMGA基因的miR下調能夠增加人垂體腺瘤中HMGA蛋白表達〔18,19〕。miR能夠通過抑制HMGA1的轉錄從而抑制HMGA1的表達〔20〕。當強制增強miR-296表達后,能夠上調HMGA1表達,降低人前列腺癌細胞的侵襲和增殖表明HMGA1能夠成為miR靶基因發揮作用〔21〕。本研究提示,miR-424-5P通過靶向調控HMGA1控制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲。

miR-424-5P能否成為臨床上治療胃癌的作用靶點,仍需要大量的體內外數據證實,從而為胃癌的治療提供新的靶點和治療策略。