miR-375-3p過表達(dá)調(diào)控Akt-eNOS信號(hào)通路促進(jìn)心肌梗死大鼠心肌修復(fù)作用機(jī)制

熊浩倫 樓定進(jìn) 王央

(義烏市中心醫(yī)院,浙江 義烏 322000)

心肌梗死(MI)是當(dāng)冠狀動(dòng)脈發(fā)生病變時(shí),導(dǎo)致冠狀供血突然減少、中斷,讓心肌長(zhǎng)時(shí)間處于急性缺血的狀態(tài),最終引發(fā)心肌出現(xiàn)缺血性的壞死〔1,2〕。當(dāng)MI發(fā)生后,心肌細(xì)胞喪失再生能力,不能修復(fù)壞死的心肌細(xì)胞。目前臨床上常采用藥物、手術(shù)介入等治療手段,雖然其治療方法一直推陳出新,但仍有大部分患者由于過度心室重構(gòu)而發(fā)展為心力衰竭,嚴(yán)重影響預(yù)后〔3〕。因此,有效改善MI患者的心肌修復(fù)從而降低患者死亡率和致殘率是臨床面臨的難題。微小RNA(miRNA)是非編碼小分子RNA中的一種,通過與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(UTR)互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合而抑制靶mRNA的翻譯或促進(jìn)靶mRNA的降解從而降低目標(biāo)蛋白的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)作用〔4,5〕。隨著對(duì)miRNAs研究的不斷深入,已證實(shí)miRNAs在心肌細(xì)胞分化和心臟發(fā)育過程中也發(fā)揮著極其重要的作用〔6〕。生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn),miR-375在進(jìn)化上高度保守,經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)miR-375-3p的研究目前主要集中于肺發(fā)育和胰島功能等方面〔7〕,但其對(duì)心肌的研究尚無(wú)報(bào)道。此外,除了miRNAs,多條信號(hào)通路都和MI有關(guān),其中其中挽救激酶通路途徑的磷酸肌醇3激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶(PI3K/Akt)介導(dǎo)MI的發(fā)生發(fā)展,內(nèi)皮型一氧化氮(NO)合酶(eNOS)是該途徑的一個(gè)下游靶點(diǎn),也是產(chǎn)生信號(hào)分子NO的關(guān)鍵酶,PI3K/Akt-eNOS信號(hào)通路介導(dǎo)了缺血后處理減輕心肌缺血再灌注損傷的作用〔8,9〕。研究發(fā)現(xiàn),Akt和eNOS可有效調(diào)控缺血組織的血管再生,對(duì)缺血組織血流動(dòng)力學(xué)異常有明顯的改善作用〔10〕,但Akt-eNOS信號(hào)對(duì)MI調(diào)控還不十分明確。因此本研究制備MI大鼠模型,觀察過表達(dá)miR-375-3p通過調(diào)控Akt-eNOS通路對(duì)其心肌修復(fù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只雄性SD清潔級(jí)大鼠均購(gòu)自遼寧省本溪實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):SCXK(遼)2013-0009。體質(zhì)量(180±20)g,統(tǒng)一飼養(yǎng)在室溫25～26 ℃、相對(duì)濕度55%～70%的動(dòng)物房?jī)?nèi),光照12 h一循環(huán)為晝夜交替。本研究獲得遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)研究均符合中國(guó)倫理委員會(huì)有關(guān)動(dòng)物研究指導(dǎo)原則。

1.2試劑與儀器 miR-375-3p mimics慢病毒和mimics NC 空病毒(上海吉瑪基因有限公司,批號(hào)150292);Akt、pAkt、eNOS、p-eNOS多克隆抗體(Cell Signaling公司,批號(hào)分別為4691P、4060S、9572S、9571S);聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物序列(Invitrogen公司,批號(hào)RR037Q);血清肌鈣蛋白(cTnT)I檢測(cè)試劑盒(濰坊祺翔生物科技有限公司);乳酸脫氫酶(LDH,上海康朗生物科技有限公司);腦鈉肽前體(Pro-BNP,杭州普望生物技術(shù)有限公司);80-2臺(tái)式低溫離心機(jī)(Pro-BNP,上海醫(yī)療器械有限公司);4X41RF顯微鏡(OLYMPUS公司);SABA-18全自動(dòng)生化分析儀(AMS公司)。

1.3雙熒光素酶報(bào)告基因 將長(zhǎng)至80%融合度的HEK-293細(xì)胞,胰蛋白酶消化后以適當(dāng)密度接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將構(gòu)建好的Akt-3′-UTR-WT、Akt-3′-UTR-MUT、eNOS-3′-UTR-WT、eNOS-3′-UTR-MUT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染miR-NC(NC組),miR-375-3p mimics(miR-375-3p組)共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,按照雙試劑盒操作步驟檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.4分組和模型制備 按照數(shù)字表法,將40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組;MI模型(MI)組;陰性對(duì)照(NC)組給予mimics NC空病毒干預(yù);miR-375-3p組給予miR-375-3p mimics慢病毒干預(yù),每組各10只。常規(guī)復(fù)合麻醉劑腹腔注射麻醉后將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)中,將心電圖電極連接于四肢皮下組織,術(shù)中記錄心電圖變化情況。于胸骨上窩正中處做一切口,向下端鈍性分離并將下頜下腺推開,將氣管顯露于手術(shù)視野中,環(huán)形氣管切開后插入自制氣管插管,深度1.0 cm,人工控制大鼠呼吸頻率。于胸骨左旁第3～4肋間做一切口,分離皮下組織和肌肉后撐開肋骨,暴露心臟,找到左冠狀動(dòng)脈前降支起始部,使用6-0縫合線穿刺左冠狀動(dòng)脈前降支,并與部分心肌共同結(jié)扎,完成后觀察左室壁是否出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)減弱和室壁蒼白,觀察心電圖出現(xiàn)ST段明顯抬高證明模型制備完成。觀察15 min無(wú)異常后進(jìn)行止血,縫合切口后行常規(guī)氣管插管,大鼠可自主呼吸后將插管移除,縫合切口,常規(guī)切口清洗消毒。sham組僅在左冠狀動(dòng)脈前降支穿線,但不結(jié)扎。

1.5藥物干預(yù) miR-375-3p組在大鼠心臟多點(diǎn)位注射10 μl miR-375-3p mimics慢病毒干預(yù);NC組在大鼠心臟多點(diǎn)位注射10 μl mimics NC空病毒干預(yù);sham組和MI組給予等量生理鹽水多點(diǎn)位注射心臟。所有大鼠連續(xù)注射7 d。

1.6RT-PCR檢測(cè)miR-375-3p表達(dá) 取各組大鼠心肌組織,無(wú)菌環(huán)境下研磨組織,將研磨液置于離心管中上機(jī)離心5 min,3 500 r/min。收集上清液于總RNA檢測(cè)試劑盒中,提取總RNA,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。引物序列:miR-375-3p上游引物:5′-CACATTTGTTCGTTCGGCTC-3′,下游:5′-ATCCA-GTGCGTGTCGTGGA-3′;β-actin上游引物:5′-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′,下游:5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′。RT體系為10 μl,取2.0 μl模板(cDNA)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系在95 ℃下變性5 min,循環(huán)條件為95 ℃ 30 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,共45個(gè)循環(huán),最后延伸5 min。分離電泳產(chǎn)物并拍照。通過凝膠灰度分析儀對(duì)實(shí)驗(yàn)條帶進(jìn)行掃描得出條帶灰度值,每個(gè)實(shí)驗(yàn)灰度取平均值。

1.7心功能檢測(cè) 治療1 w后以水合氯醛麻醉大鼠,備皮后右側(cè)臥位固定在小型動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上,利用小型動(dòng)物專用彩色超聲影像系統(tǒng)檢測(cè)左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、 左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、短軸縮短率(FS)、 左室射血分?jǐn)?shù) (LVEF)。4 個(gè)參數(shù)測(cè)定值均取3個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期平均值。

1.8血清心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè) 取各組大鼠尾靜脈血于離心管中,離心收集上清液,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒檢測(cè)血清中cTnTI、LDH、Pro-BNP水平。在500 μl樣本稀釋液中加入5 μl 血清樣本混勻,在各反應(yīng)孔中加入稀釋的10 μl 血清樣本,然后將100 μl 酶試劑加入各反應(yīng)孔中,25 ℃放置45 min,水洗、吸干后加入100 μl顯色劑,室溫孵育20 min,加入終止液,在450 nm處利用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值,計(jì)算樣本濃度。

1.9MI面積測(cè)定 待大鼠完成心功能檢測(cè)后,麻醉大鼠后取出心臟,以磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗干凈,在心尖部穿棉繩,將心臟懸掛于-20 ℃冷凍20 min;取出心臟后在錫箔紙上橫切為3 mm的薄片,加入2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液37 ℃恒溫染色60 min,每10 min翻動(dòng)1次;置于中性甲醛溶液中固定24 h,利用Image Pro plus60軟件分析心肌梗死面積。心肌梗死面積(%)=(梗死面積/左心室總面積)×100%。

1.10心肌組織病理學(xué)變化 麻醉各組大鼠,取出心臟,獲取左心室心肌組織,置于多聚甲醛中固定24 h,石蠟包埋組織,切成5 μm的薄片,蘇木素-伊紅(HE)染色組織薄片,封片后顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.11Western印跡檢測(cè)心肌組織Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表達(dá) 取各組左室缺血區(qū)心肌組織200 mg,裂解,研磨組織制成勻漿,離心,收集上清液并測(cè)定總蛋白含量。取30 μg蛋白上樣煮沸、電泳、聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)印。封閉組織后加入一抗和二抗,充分混勻后孵育5 min,一抗稀釋液加入組織中,充分混勻后轉(zhuǎn)至PVDF膜上,成像、顯色,測(cè)定蛋白灰度值。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1雙熒光素酶報(bào)告 構(gòu)建載體后行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-375-3p后顯著增加Akt和eNOS活性(P<0.05),但對(duì)突變基因的影響不明顯(P>0.05)。表明Akt和eNOS可能是miR-375-3p的靶基因,見表1。

表1 雙熒光素酶報(bào)告

2.2各組心肌組織miR-375-3p表達(dá)比較 MI組、NC組心肌組織miR-375-3p表達(dá)顯著低于sham組(P<0.05),且MI組和NC組心肌組織miR-375-3p表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05);miR-375-3p組心肌組織中miR-375-3p表達(dá)顯著高于sham組及MI組(P<0.05),見表2。

表2 各組心肌miR-375-3p表達(dá)、LVEDD 、LVESD、FS、LVEF及MI面積比較

2.3各組心功能指標(biāo)比較 和sham組相比,MI組、NC組及miR-375-3p組LVEDD、LVESD顯著升高,FS、LVEF顯著降低(P<0.05),且MI組和NC組LVEDD、LVESD、FS、LVEF比較無(wú)顯著差異(P>0.05);和MI組相比,miR-375-3p組LVEDD、LVESD顯著降低,FS、LVEF顯著升高(P<0.05),見表2。

2.4各組MI面積比較 MI組、NC組及miR-375-3p組MI面積較sham組顯著增加(P<0.0.5),且MI組和NC組無(wú)顯著差異(P>0.05);miR-375-3p組MI面積明顯少于MI組(P<0.05),見表2、圖1。

圖1 各組心肌組織TTC染色

2.5各組心肌組織Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表達(dá)比較 和sham組相比,MI組、NC組及miR-375-3p組Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);MI組和NC組Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白變化無(wú)顯著差異(P>0.05);和MI組相比,miR-375-3p組Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白均顯著增加(P<0.05),見圖2、表3。

圖2 Western印跡檢測(cè)各組心肌組織Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表達(dá)

表3 各組心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH、cTnTI、Pro-BNP及Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表達(dá)比較

2.6各組心肌損傷指標(biāo)比較 和sham組相比,MI組、NC組及miR-375-3p組LDH、cTnTI、Pro-BNP均顯著增加(P<0.05),且MI組和NC組LDH、cTnTI、Pro-BNP表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05);和MI組相比,miR-375-3p組LDH、cTnTI、Pro-BNP顯著降低(P<0.05),見表3。

2.7各組心肌組織病理學(xué)變化比較 和sham組相比,MI組心肌組織損傷嚴(yán)重,心肌細(xì)胞排列無(wú)規(guī)則,纖維組織腫脹嚴(yán)重,細(xì)胞核出現(xiàn)固縮且有大量細(xì)胞核碎裂,甚至出現(xiàn)溶解,心肌組織中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),大量壞死心肌細(xì)胞出現(xiàn);NC組心肌組織和MI組無(wú)明顯差異。干預(yù)后miR-375-3p組心肌組織較MI組得到明顯改善,壞死的心肌細(xì)胞減少,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)也明顯減少,見圖3。

圖3 各組心肌組織病理學(xué)(HE染色,×200)

3 討 論

MI是心臟外科最常見的急癥之一,是指由于冠狀動(dòng)脈阻塞引發(fā)持久而嚴(yán)重的心肌缺血所導(dǎo)致的部分心肌壞死,多出現(xiàn)心律失常、心力衰竭、發(fā)熱、急性循環(huán)功能障礙和血清心肌損傷標(biāo)記酶的升高,可并發(fā)休克或心力衰竭〔11,12〕,是導(dǎo)致心衰的重要病因。長(zhǎng)久以來認(rèn)為,由于心肌細(xì)胞在出生后即進(jìn)入終末分化退出細(xì)胞周期,心肌損傷導(dǎo)致的心肌細(xì)胞減少是不可逆的過程。然而,越來越多的研究證明哺乳動(dòng)物的心臟處于一個(gè)細(xì)胞持續(xù)循環(huán)的狀態(tài),具有再生潛力,這為MI后心衰的治療帶來的曙光〔13〕。近些年隨著對(duì)MI病理生理機(jī)制研究的深入及新技術(shù)、新藥的不斷出現(xiàn),MI的住院病死率已經(jīng)明顯下降。但是對(duì)大面積MI患者來說,即使及時(shí)給予積極的藥物及再灌注治療,但終因MI范圍較大,且部分患者錯(cuò)過了最佳的治療時(shí)機(jī)而導(dǎo)致患者發(fā)生心力衰竭。miRNA可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移過程參與疾病的發(fā)生、發(fā)展過程,且部分miRNA還可以作為評(píng)估患者病情及預(yù)后的生物標(biāo)志物〔14〕。有研究表明,miRNA參與急性MI缺血再灌注損傷,在缺血再灌注早期可以出現(xiàn)心肌表達(dá)miRNA的改變,miRNA有望成為減輕心肌缺血再灌注的治療靶點(diǎn)〔15〕。有報(bào)道證實(shí),miR-375主要參與內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、孕前及妊娠期肥胖等〔16〕。

本實(shí)驗(yàn)制備MI大鼠模型并給予過表達(dá)miR-375-3p,其在大鼠體內(nèi)表達(dá)增加說明慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。MI是心血管疾病患者常見死亡原因。MI常發(fā)生血流動(dòng)力學(xué)異常,心臟收縮、舒張功能降低、心肌耗氧量增加,其是評(píng)價(jià)MI好壞的關(guān)鍵指標(biāo)〔13〕。本研究結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-375-3p能改善MI大鼠心臟收縮、舒張功能,改善心室順應(yīng)性。占天為等〔17〕發(fā)現(xiàn),MI大鼠LVEDD 、LVESD升高、FS、LVEF降低,益氣活血方能夠提高M(jìn)I大鼠心功能,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。臨床實(shí)踐證明,血清心肌酶水平可反映心肌細(xì)胞的損傷程度,包括LDH、肌酸激酶、cTnTI、Pro-BNP等,其中以cTnTI表達(dá)水平的敏感性和特異性最高,為目前較理想的MI標(biāo)志物〔18〕。本研究結(jié)果說明,miR-375-3p能抑制受損心肌細(xì)胞釋放出的活性酶,修復(fù)受損心肌,與羅遠(yuǎn)林等〔19〕研究結(jié)果相似。袁輝等〔20〕研究證實(shí),模型成功后不同時(shí)間伴有血清酶譜LDH、肌酸磷酸激酶(CK)、cTnT表達(dá)水平升高,表明成功復(fù)制了大鼠MI模型。

Akt-eNOS是再灌注損傷補(bǔ)救酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的組成之一,通過影響下游相關(guān)蛋白的表達(dá),產(chǎn)生心臟保護(hù)作用,主要依賴于Akt的磷酸化,活化的Akt可通過下游多個(gè)效應(yīng)器,如活化的Akt磷酸化eNOS誘導(dǎo)內(nèi)源性NO生成〔21〕。該通路有多種效應(yīng)分子,而Akt處于這一通路的中心環(huán)節(jié),也是最主要的靶酶,只有磷酸化的Akt才具有抗凋亡、蛋白合成及促細(xì)胞生存等活性。MI發(fā)生時(shí),組織中的eNOS表達(dá)被促進(jìn),介導(dǎo)血流的調(diào)節(jié),對(duì)血管痙攣有很好的抑制作用,進(jìn)而減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等灌注損傷。本研究結(jié)果顯示,Akt、eNOS及其磷酸化在MI大鼠中低表達(dá),過表達(dá)miR-375-3p可促進(jìn)Akt-eNOS信號(hào)通路的激活。miR-375-3p過表達(dá)可激活A(yù)kt-eNOS信號(hào)通路,增加效應(yīng)蛋白Akt磷酸化,激活下游靶目標(biāo)eNOS,從而發(fā)揮對(duì)MI的保護(hù)作用。邵玲等〔22〕研究證實(shí),楊梅素對(duì)MI后心臟重構(gòu)有很好改善作用,其機(jī)制與Akt信號(hào)通路被激活有關(guān)。He等〔23〕研究證實(shí),miR-375通過下調(diào)蛋白激酶D(PDK)1的表達(dá)、抑制Akt的激活及影響焦激酪酸激酶(FAK)的絡(luò)氨酸磷酸化,進(jìn)而抑制細(xì)胞遷移。