西瑞香素通過介導巨噬細胞向M2極化對鼻咽癌大鼠線粒體通路的影響

王虹園 王繼國 任慶

(天津市第五中心醫院耳鼻咽喉科,天津 300450)

鼻咽癌是發生于鼻咽腔頂部和側壁的耳鼻喉科常見惡性腫瘤,其發病率位居耳鼻咽喉惡性腫瘤之首,5年生存率僅為30%,且極易復發,對患者的身體健康及生命安全造成了極大威脅〔1〕。臨床上因鼻咽癌對放療敏感性較高,故對于鼻咽癌患者的治療首選方法為放射治療,同時根據患者的癌癥分期及耐受性給予化學治療及手術治療〔2〕。雖然這些治療手段在臨床上取得了明顯的治療效果,但其毒副作用嚴重,且很容易產生不同程度的后遺癥,因此探尋新型有效且安全性高的治療藥物就顯得尤為必要。鼻咽癌的病因目前尚未完全闡明,但有研究表明,炎癥及免疫系統紊亂是絕大多數癌癥的發病根源,鼻咽癌也是如此,而巨噬細胞極化在其中發揮著不可忽視的作用〔3〕。巨噬細胞因其位置和微環境不同可極化為M1型和M2型,M1型巨噬細胞具有抗腫瘤免疫功能,而M2型巨噬細胞則可介導免疫抑制的形成,從而促進癌細胞的生長及轉移〔4〕。有研究發現,細胞凋亡程序的紊亂與腫瘤等多種疾病的發生密切相關,細胞凋亡對于維持組織穩態和預防癌癥發展至關重要〔5〕。而介導細胞凋亡主要有3條通路,即線粒體通路、死亡受體通路及內質網通路,其中線粒體作為細胞凋亡的調控中心,在調控細胞凋亡信號轉導中具有起始、整合與信號放大的作用,因此線粒體通路是本文研究的重點〔6〕。西瑞香素是以醚鍵結合的雙香豆素類衍生物,是天然藥物的一種,具有低毒、來源廣、生物活性多樣的特點,同時其在抗炎、抗病毒、抗腫瘤等方面發揮著重要作用〔7〕。但其對于鼻咽癌的研究相對較少,因此本文就西瑞香素通過介導巨噬細胞向M2極化對鼻咽癌大鼠線粒體通路的影響進行研究探討,為臨床治療鼻咽癌提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1動物 選取北京維通利華實驗動物技術有限公司提供的40只SPF級SD雄性大鼠〔合格證書:SCXK(京)2019-0051〕,平均體質量200～250 g,大鼠單籠喂養,室溫生長,模仿12 h晝夜交替,在常溫下進行無菌自由進食、飲水2 w,按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗。

1.2儀器與試劑 鹽酸千金藤堿(A141282,上海邦景實業有限公司);西瑞香素(D1453-20 mg,上海寶曼生物科技有限公司);二亞硝基哌嗪(SCSI-316048,上海賽可銳生物科技有限公司);佛波醇酯(YC-1509,安徽永純生物技術有限公司);TUNEL檢測試劑盒、生理鹽水(YT2205、YT3740,北京伊塔生物科技有限公司);重組末端核苷酸轉移酶(rTdT,10533065,北京泰澤嘉業科技發展有限公司);碘化丙啶(PI)染液(JKMK1509A,上海經科化學科技有限公司);實時Real-Time聚合酶鏈反應(PCR)儀(7500,美國 Invitrogen公司);實時Real-Time PCR 試劑盒(7000,美國ABI公司);Trizol試劑(NR0002,雷根生物科技有限公司);cDNA 第一鏈合成試劑盒(KR104,北京天根生化科技有限公司);十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、電化學發光(ECL)檢測試劑盒、全蛋白抽提試劑盒(KGP113、KGP1123、KGP250,江蘇凱基生物科技發展有限公司);高速冷凍離心機(5024R,德國Eppendorf公司);光學顯微鏡(CX-60,日本OLYMPUS公司);自動包埋機(EG1150,德國Leica公司);蘇木素染液(H9627,美國Sigma公司);伊紅染液(AG1100-100 ml,上海吉至生化科技有限公司);percoll分離液(P7828-100 ml,上海聯碩寶為生物科技有限公司);CD68抗體、CD163抗體(11192-MM06、100473-T36,北京義翹神州科技股份有限公司);檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH6.0,ZKP0789,深圳子科生物科技有限公司);甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(60004-1-Ig,美國Proteintech公司);多聚甲醛(158127,Sigma-Aldrich-LLC.公司)。

1.3分組與模型制備 選取40只SPF級SD雄性大鼠,隨機分為正常(N)組,模型(M)組,鹽酸千金藤堿(C)組,西瑞香素(W)組,每組10只。各組在建模前10 h禁食、禁水,然后對M、C、W組給予腋部皮下注射誘癌劑二亞硝基哌嗪15 mg/kg及促癌劑佛波醇酯100 mg/kg,3 d注射1次,連續注射28次,當大鼠打噴嚏超10次、并出現抓鼻不止、流涕滿面等現象時則視為建模成功,N組不建立該模型,同期給予同體積生理鹽水。建模成功后,對C組灌胃15 mg/kg鹽酸千金藤堿,對W組灌胃24 mg/kg西瑞香素,兩組均1次/d,持續21 d,N組、M組同期給予灌胃同體積生理鹽水。

1.4標本采集 各組實驗結束后安樂死,并迅速游離出上頜骨,于冰上取出鼻咽組織,多久甲醛固定96 h,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后放入冰箱中密封保存。

1.5鼻咽組織病理檢測 取部分鼻咽組織,用梯度乙醇及二甲苯進行脫水后,進行常規石蠟包埋、切片、脫蠟及復水,然后用蘇木素-伊紅(HE)染液進行染色,除去多余染液后,梯度乙醇及二甲苯脫水、透明后,進行中性樹膠封片處理,用光學顯微鏡進行組織病理學觀察。

1.6鼻咽組織細胞凋亡檢測 采用末端脫氧核苷酸標記法(TUNEL),取部分鼻咽組織石蠟包埋、切片、脫蠟及水化后與蛋白酶K進行室溫孵育10 min,多聚甲醛及PBS分別浸泡5 min,除去多余液體后,將切片浸入聯合抗生物蛋白過氧化氫酶和二氨基聯苯胺的平衡液中,室溫下放置10 min,取出PBS沖洗3次,加入rTdT,在37 ℃、避光的條件下孵育60 min,將切片浸入鹽類-檸檬酸鹽緩沖液(SSC)溶液中,溫室放置15 min后PBS洗滌2次,用PI進行染色,在熒光顯微鏡下觀察,(520±20)nm處觀察綠色熒光,>620 nm處觀察紅色PI,細胞核中綠色熒光為凋亡細胞,隨機選擇5個視野下的細胞觀察凋亡率。凋亡率=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%。

1.7線粒體通路相關指標檢測 RT-PCR法檢測線粒體通路中B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X基因(Bax)及細胞色素(Cyto)-C mRNA表達,取各組鼻咽組織制成勻漿后,加入Trizol試劑以提取總RNA,紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度,提取完成后用電泳儀檢測其完整性,用cDNA 第一鏈合成試劑盒進行逆轉錄合成 cDNA,然后在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,在94 ℃條件下,預變性10 min,變性30 s,70 ℃延伸1 min,59 ℃退火30 s,以此循環40次,熒光實時定量PCR儀收集Bcl-2、Bax及Cyto-C熒光信號,反應結束后進行數據分析,以同一樣本中的GAPDH的Ct值作為內參,采用 2-ΔΔCt計算其基因相對表達量,引物序列:Bcl-2上游ACAGGTGTAAGCCACCGAAC,下游GTTGCAGTGAGCCAAGATCA;Bax上游TGGTGAAACCTTGTCTGCAC,下游CTTTGCCTTCTGGGTTCAAG;Cyto-C上游GGAGAGGATACCCTGATGGA,下游GTCTGCCCTTTCTCCCTTCT;GAPDH上游GTAAGAAACCCTGGACCACC,下游CTGGGATGGAATTGTGAGGG。

1.8鼻咽組織中巨噬細胞極化特異性標志物檢測 Western印跡法檢測大鼠鼻咽組織中M1型特異性標志物CD68及M2型特異性標志物CD163蛋白表達:取各組鼻咽組織,剪碎后加入1 ml RIPA裂解液,在冰上充分攪拌10 min,在4 ℃、12 000 r/min的條件下離心20 min,取上清液,用二喹啉甲酸(BCA)法測定,將各組蛋白調至等濃度后進行電泳,電泳完成后,用半干法將凝膠上蛋白轉移至甲醇活化的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,轉膜1.5 h、封閉2 h,加入稀釋的CD68、CD163一抗(1∶1 000),4 ℃搖床振蕩孵育過夜后洗膜;加入稀釋的二抗(1∶5 000),37 ℃輕搖室溫孵育 2 h;洗膜后,用電化學發光(ECL)熒光試劑盒測定結果,計算與GAPDH比值求得CD68、CD163蛋白的相對表達。

1.9巨噬細胞檢測 取M組鼻咽組織剪碎置于離心管中,加入Ⅳ型膠原酶使其終濃度為1 mg/ml,在37 ℃、300 r/min條件下,搖床上搖晃1 h,過濾離心,棄掉上清液后重懸,再次離心,棄掉上清液重懸,在4 ℃下沉淀離心3次,取3次上清液,將3次上清液混合后,在4 ℃下離心5 min,棄掉上清液重懸,將其小心鋪到25%～50%的percoll上方,每部分體積為4 ml,然后在室溫、2 000 r/min、降速調為1的條件下進行梯度離心20 min,離心后在25%與50%界限處的為巨噬細胞。體外巨噬細胞極化實驗:將得到的巨噬細胞進行體外常規培養,取培養后的巨噬細胞,將其分為兩組,加入PBS記為A組,加入西瑞香素記為B組,兩組共培養后,用Western印跡法檢測CD68及CD163蛋白表達。

1.10統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析,事后檢驗采用SNK法,組間兩兩比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1各組HE染色 N組鼻咽組織細胞層次清晰且大小均勻,排列整齊;M組細胞層次變多,細胞形態及排列均不整齊,可見多細胞核且染色明顯變深,出現大量鱗狀上皮增生及炎性細胞浸潤,而C、W兩組癥狀明顯改善,且W組比C組改善明顯。見圖1。

圖1 各組鼻咽組織結構(HE染色,×200)

2.2各組細胞凋亡 與N組〔(15.36±1.20)%〕比較,M組細胞凋亡率〔(4.55±1.10)%〕明顯降低(P<0.05);與M組比較,C〔(8.66±1.10)%〕、W組細胞凋亡率〔(12.35±1.10)%〕均明顯升高(P<0.05);與C組相比,W組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組細胞凋亡(×400)

2.3各組線粒體通路相關指標 與N組比較,M組鼻咽組織中Bcl-2 mRNA表達顯著升高,Bax、Cyto-C mRNA表達顯著降低(P<0.05)。與M組比較,C、W組鼻咽組織中Bcl-2 mRNA表達顯著降低,Bax、Cyto-C mRNA表達明顯升高(P<0.05),且W組比C組變化顯著。與C組比較,W組Bcl-2 mRNA表達顯著降低,Bax、Cyto-C mRNA表達顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組線粒體通路相關指標比較

2.4各組鼻咽組織巨噬細胞中CD68及CD163蛋白表達 與N組比較,M組鼻咽組織巨噬細胞中CD68蛋白表達顯著降低,CD163蛋白表達顯著升高(P<0.05)。與M組比較,C、W兩組鼻咽組織巨噬細胞中CD68蛋白表達顯著升高,CD163蛋白表達顯著降低(P<0.05),且W組比C組變化顯著。與C組比較,W組CD68蛋白表達顯著升高,CD163蛋白表達顯著降低(P<0.05)。與A組比較,B組CD68蛋白表達顯著增加,CD163蛋白表達顯著降低(P<0.001)。見表2、圖3。

表2 各組鼻咽組織巨噬細胞中CD68及CD163蛋白表達

圖3 Western印跡檢測各組CD68及CD163蛋白表達

3 討 論

我國是鼻咽癌發病率最高的國家,且近年來有逐漸上升趨勢,對患者的生產生活造成了極大影響,因此探尋一種有效的治療手段顯得尤為重要〔8〕。目前,臨床上治療鼻咽癌的方法不多,效果也不理想,中醫治療鼻咽癌具有使用方便、價格低廉的優勢,所以在治療鼻咽癌方面具有廣闊的前景〔9〕。西瑞香素是民間常用中草藥了哥王的有效藥用成分,其在抗焦慮、降低心肌耗氧量、抗炎鎮痛及抗癌等方面都具有重要作用〔10〕。中醫認為腫瘤的形成在于“正氣虛則成巖,邪之所湊,其氣必虛”,鼻咽癌的病因亦然,現代研究表明,中藥的藥性溫和且毒副作用小,其在治療鼻咽癌方面比單純使用現代醫學治療更具優越性,發展前景也更廣闊〔11〕。而對于鼻咽癌大鼠,西瑞香素可能是通過調節機體陰陽平衡來增強機體免疫力,從而抑制癌細胞的核酸與蛋白質合成,抑制過氧化脂質的形成、促進受損黏膜修復等,進而達到改善局部微循環、抑制腫瘤組織生長的目的,最終使癥狀得到有效緩解。呂品〔12〕研究表明,西瑞香素對人骨肉瘤、宮頸癌、鼻咽癌等均具有抗腫瘤作用,并可有效抑制乳腺癌細胞增殖,其有望成為新型抗腫瘤藥物,具有良好的發展前景。本研究也發現,西瑞香素可明顯改善鼻咽癌大鼠病理形態,說明西瑞香素具有很好的療效。

細胞凋亡是一個多因素、多基因共同調控的復雜過程,是機體維持內穩態的重要組成部分,一旦平衡遭到破壞,就會引發各種疾病〔13〕。而在調控細胞凋亡的相關通路中,線粒體通路占有重要地位,其中Bcl-2等抗凋亡因子及Bax、Cyto-C等促凋亡因子在細胞凋亡線粒體途徑中起關鍵作用〔14〕。鼻咽癌的發生就是多基因表達異常的結果,且目前普遍認為腫瘤細胞凋亡過少是腫瘤持續發展的主要原因,因此如何促進細胞凋亡是臨床治療鼻咽癌的工作重點之一〔15〕。本研究說明,西瑞香素可有效調控線粒體通路,促進細胞凋亡。對于鼻咽癌大鼠,西瑞香素可能是通過抑制原癌基因、促進抑癌基因,來激活相關凋亡信號,從而抑制Bcl-2的表達,刺激Bax 蛋白移位到線粒體外膜并刺激線粒體釋放Cyto-C,進而促進凋亡小體的形成,最終達到誘導細胞凋亡、抑制腫瘤生長的目的。張玉靜〔16〕研究發現,西瑞香素可顯著促進神經母細胞瘤凋亡,抑制其增殖,并能夠阻滯細胞周期,降低線粒體膜電位,與本文結果類似。

腫瘤微環境是腫瘤細胞賴以生存的主要場所,其中免疫細胞是腫瘤微環境中的重要組成成分。巨噬細胞是免疫細胞的一種,目前由巨噬細胞介導的過度免疫反應已被公認為是腫瘤發生發展的第7大標志,而巨噬細胞主要通過極化來對腫瘤的凋亡、轉移等方面產生作用〔17〕。CD68和CD163分別是M1型及M2型特異型標志物,通過對其表達的檢測,可明確巨噬細胞極化情況〔18〕。而西瑞香素可能是通過影響腫瘤細胞釋放信號因子,來破壞微環境平衡,從而抑制巨噬細胞聚集、浸潤,進而到達調節機體免疫系統,提高免疫力的目的。本文結果證明,西瑞香素是通過誘導巨噬細胞向M1極化、抑制其向M2極化來達到調控線粒體通路的目的,最終使鼻咽癌癥狀改善。楊榮剛等〔19〕研究發現,柴胡多糖可顯著抑制巨噬細胞向M2巨噬細胞極化,促進M1極化,并顯著上調促炎因子分泌,這與本文結果類似。

綜上所述,西瑞香素可影響大鼠線粒體通路表達,促進鼻咽癌細胞凋亡,其作用機制可能與抑制巨噬細胞向M2型極化有關。