溶血、脂肪血及保存條件對(duì)HBV DNA、HIV RNA 核酸檢測(cè)的影響

郝 丹

（華龍區(qū)婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心，河南 濮陽 457000）

血液安全是關(guān)乎人們健康的重要舉措，為了確保血液制品的安全，及早檢出病毒變異以及隱匿性感染的污染血液，在對(duì)污染血液測(cè)定上，核酸檢測(cè)是一種科學(xué)手段，借助這一技術(shù)能夠?qū)ρ哼M(jìn)行篩查［1］。但是實(shí)際進(jìn)行核酸檢測(cè)上，標(biāo)本溶血、脂肪血等影響血液制品質(zhì)量的因素明顯影響核酸檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，這樣顯然不利于疾病的早期診斷及治療，因此進(jìn)一步提高核算檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性也成為廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)話題之一［2］。為了尋找出適合本區(qū)域用于指導(dǎo)核酸檢測(cè)操作的標(biāo)本采集、運(yùn)輸、處理以及保存的合理控制對(duì)策，本次研究中對(duì)乙肝病毒脫氧核糖核酸與人類免疫缺陷病毒脫氧核糖核酸標(biāo)本采集、運(yùn)輸、處理、檢驗(yàn)、保存過程進(jìn)行研究探討，分析標(biāo)本溶血、脂肪血、保存條件對(duì)于HBV DNA 與HIV DNA 檢測(cè)結(jié)果的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019 年1 月～2021 年1 月華龍區(qū)婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心經(jīng)血清學(xué)檢測(cè)乙肝表面抗原、丙肝病毒抗體、人類免疫缺陷病毒抗體均陰性的80 例透亮血漿標(biāo)本。收集以上時(shí)間段HBV DNA、HIV DNA 測(cè)定陽性血漿，通過病毒濃度定量測(cè)定，制備12-30 倍核酸試劑以測(cè)定下限濃度HBV DNA、HIV DNA 標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 儀器、試劑 Coba s201 核酸檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)羅氏公司）；BC-3000 全自動(dòng)細(xì)胞分析儀（邁瑞）；Bc-400 全自動(dòng)生化分析儀（邁瑞）；DL-6M大容量低溫離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘麓）；COBAS TaqScreen MPX V2.0test 核酸檢測(cè)試劑盒（瑞士Roche 公司）；三酰甘油試劑盒（上海科華）；血細(xì)胞分析用溶血?jiǎng)ㄟ~瑞南京生物技術(shù)有限公司）。

1.2.2 溶血、脂肪血標(biāo)本核酸檢測(cè) 收集患者4h、24h、48h、72h、1周時(shí)間段結(jié)果均是陰性紅細(xì)胞懸液以及嚴(yán)重的乳糜血漿。放入到溫度大小在-80℃冰箱下進(jìn)行保存，對(duì)相應(yīng)標(biāo)本進(jìn)行離心處理，主要是3000r/min 的速度持續(xù)離心15min 分離血清溶血或者脂肪血樣本、透亮血漿標(biāo)本、12-30 倍LOD 濃度HBV DNA 與HIV DNA 標(biāo)本，混勻后制備成血紅蛋白濃度分別為97g/L、34g/L、17g/L、8g/L、5g/L、3g/L 溶血標(biāo)準(zhǔn)的樣本，三酰甘油濃度分別為7.93mmol/L、3.80mmol/L、2.63mmol/L、1.83mmol/L、1.49mmol/L。

1.2.3 不同保存條件的標(biāo)本核酸檢測(cè) HBV DNA 與HIV DNA 標(biāo)本置于溫度4℃、25℃、37℃、-30℃環(huán)境下保存，各環(huán)境下保存各組5 分樣本，之后在4h、24h、48h、72h、1 周的時(shí)間段進(jìn)行核酸檢測(cè)，核酸檢測(cè)借助實(shí)時(shí)熒光PCR 法在患檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 對(duì)照樣品核酸檢測(cè) 1 份HBV DNA 與HIV DNA實(shí)驗(yàn)標(biāo)本、5 份血清學(xué)、核酸測(cè)定的結(jié)果為正常并且標(biāo)本外觀透亮混樣標(biāo)本，對(duì)照樣品為無溶血以及正常TG 濃度情況，參照溶血與脂肪血標(biāo)本核酸檢查方法進(jìn)行Hb、TG 濃度的測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采取SPSS20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果分析，核酸檢測(cè)應(yīng)用重復(fù)測(cè)定的雙因素方差分析方式，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，溶血、脂肪血、保存條件對(duì)核算檢測(cè)結(jié)果影響數(shù)據(jù)應(yīng)用單因素方差分析方法。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同標(biāo)本保存環(huán)境下HBV DNA、HIV DNA 檢測(cè)結(jié)果（見表1）

表1 不同保存條件HBV DNA 與HIV DNA 檢測(cè)結(jié)果影響循環(huán)閾值（Ct）值的比較（n=80）

2.2 溶血、 脂肪血對(duì)HBV DNA 與HIV DNA 檢測(cè)結(jié)果影響（見表2、表3）

表2 溶血與脂肪血標(biāo)本不同Hb 濃度HBV DNA、HIV DNA檢測(cè)影響Ct 值比較（n=80）

表3 溶血與脂肪血標(biāo)本不同TG 濃度HBV DNA、HIV DNA檢測(cè)影響Ct 值比較（n=80）

3 討論

羅氏核酸檢測(cè)系統(tǒng)是通過對(duì)擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行同步檢測(cè)，而若是血液標(biāo)本存在溶血以及脂肪血情況，會(huì)對(duì)檢測(cè)的性能造成影響［3］。血液標(biāo)本發(fā)生脂肪血會(huì)對(duì)核酸檢測(cè)的結(jié)果造成影響，主要是脂肪中乳糜微粒會(huì)屏蔽及吸收熒光，這樣使得熒光發(fā)生淬滅的作用，明顯降低熒光信號(hào)強(qiáng)度以及降低熒光擴(kuò)散強(qiáng)度［4］。

標(biāo)本保存條件的差異對(duì)于核酸檢測(cè)結(jié)果造成的影響，主要顯示室溫環(huán)境、4℃環(huán)境、-80℃環(huán)境下經(jīng)抗凝的標(biāo)本，標(biāo)本儲(chǔ)存30d 后發(fā)現(xiàn)測(cè)定結(jié)果未見明顯差異。而本次研究中，通過核酸檢測(cè)HBV DNA，在37℃下保存72h 與1 周測(cè)定Ct 值明顯比其他時(shí)間點(diǎn)高，這一結(jié)果表明隨著保存時(shí)間的不斷增加，存在核酸逐漸降解趨勢(shì)，因此提示在實(shí)際的檢測(cè)中需要提高重視，尤其是血液標(biāo)本在夏季進(jìn)行測(cè)定時(shí)候，為了避免標(biāo)本出現(xiàn)變質(zhì)及測(cè)定借助不準(zhǔn)確情況，應(yīng)將標(biāo)本置于冷庫(kù)中運(yùn)輸，避免因?yàn)闃?biāo)本變質(zhì)引起的結(jié)果準(zhǔn)確度降低情況［3］。HIV DNA 在不同環(huán)境以及時(shí)間下的測(cè)定結(jié)果差異基本一致，提示血液標(biāo)本HIV DNA 可長(zhǎng)時(shí)間保存，檢測(cè)結(jié)果影響小，但是因?yàn)橛^察時(shí)間最長(zhǎng)為1 周，對(duì)持續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間是否對(duì)結(jié)果造成影響的研究需要進(jìn)一步探討。

研究中，觀察溶血組的HBV DNA、HIV DNA 檢測(cè)結(jié)果除了在Hb 在97g/L 的時(shí)候受抑制未能準(zhǔn)確檢出外，而其他的Hb 濃度檢測(cè)Ct 值檢測(cè)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在各組其他的Hb 濃度下的HBV DNA、HIV DNA 檢測(cè)未受血紅蛋白濃度水平的影響。而本次研究表明高濃度TG 為對(duì)核酸檢測(cè)結(jié)果造成影響。

綜上所述，在進(jìn)行核酸的檢測(cè)中，采集的血液標(biāo)本，當(dāng)TG小于7.93mmmol/L 的時(shí)候，針對(duì)高血脂標(biāo)本可接收，而進(jìn)行檢測(cè)時(shí)標(biāo)本需同透亮的標(biāo)本進(jìn)行混合，而若是溶血標(biāo)本超過34g/L 需要及時(shí)通知送檢人員重新選擇留取樣本，并且血液標(biāo)本采集后的72h 盡早進(jìn)行檢測(cè)，采血后標(biāo)本運(yùn)輸也盡可能確保冷鏈完整，為檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性提供保障。