柚果肉顏色遺傳變異分析及候選基因挖掘

程莉，楊勝男，朱延松，王旭，趙婉彤，李仁靜，李沛，苑忠杰，江東

柚果肉顏色遺傳變異分析及候選基因挖掘

程莉，楊勝男，朱延松，王旭，趙婉彤，李仁靜，李沛，苑忠杰，江東

西南大學柑桔研究所，重慶 400712

【目的】果肉顏色是柚類品種重要的外觀性狀以及品質性狀，挖掘與柚果肉顏色顯著相關的變異位點及相關基因，為進一步理解柚類品種果肉呈色機理以及分子標記輔助育種奠定基礎。【方法】通過表型調查及色差儀測量，對100份柚類種質的果肉顏色進行評價和分類，利用GBS（genotyping-by-sequencing）測序技術對所有材料進行簡化基因組測序。將測序得到的基因型數據通過GCTA軟件計算特征值及特征向量分析群體結構，利用plink 2.0軟件計算不同果肉顏色群體的遺傳分化系數（Fst），選用GEMMA軟件中GLM模型進行全基因組關聯分析，選取與顏色表型顯著關聯的變異位點進行等位變異分析，根據柑橘LD大小對變異位點鄰近位置進行基因注釋，篩選出與果肉顏色形成相關的候選基因，隨機選擇4份白肉柚和4份紅肉柚材料在不同發育時期對候選基因表達進行初步驗證?！窘Y果】根據果肉顏色將100份柚類種質分為白肉柚和紅肉柚兩大類，其中包含58份白肉柚和42份紅肉柚。通過Fst遺傳分化指數分析和GWAS全基因組關聯分析共篩選到Fst系數大于0.4且-log10（P）＞9的位點6個，對6個變異位點進行基因分型，根據基因型能夠預測柚品種的果肉顏色。對變異位點側翼25 kb序列進行基因注釋共篩選出14個基因，其中包含類異戊二烯合成、葉綠體氧化還原反應、質體發育、脫落酸信號調節、乙烯響應等相關基因和轉錄因子?；虮磉_分析顯示，（促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶MAPKKK17）、（葉綠體卟啉原脫氨酶）、（轉錄因子TCP7）、（葉綠體超氧化物歧化酶SOD3）、（FAD合成酶2）與果肉顏色形成存在一定關聯?！窘Y論】經過GWAS和Fst兩種分析方式共鑒定到6個與果肉顏色顯著關聯的SNP位點，對該位點上下游25 kb的距離進行基因注釋共篩選到了14個基因，通過基因表達模式分析初步判定其中5個基因參與了柚果肉顏色的形成。

柚；果肉顏色；Fst；關聯分析；候選基因

0 引言

【研究意義】柚是蕓香科柑橘屬植物的一個基本種，經過長期的生物進化和栽培育種形成了豐富多樣的種質資源[1-2]，對現有資源進行鑒定、評價、分析和利用對于柚類育種改良具有重要意義。隨著我國柚類產業的發展和消費需求的多樣化，對于柚類品種的果實品質要求不斷提高。果肉顏色是柚類品種重要的品質性狀之一，在長期的栽培育種和人為選擇過程中，產生了果肉顏色豐富的變異材料[3]。近年來，研究者們在解析果肉呈色機理上已經做了大量工作，包括柚在內的柑橘屬植物果實呈色的關鍵結構基因已十分清晰[4]。但由于柑橘果樹童期長、雜交群體占地面積大、遺傳背景復雜、可利用的分子標記較少等多因素影響[5-7]，對于果實顏色的代謝調控網絡和相關基因還知之甚少，且通過構建遺傳雜交群體來對果肉顏色的相關調控因子進行精細挖掘及定位耗時長且難度大[8-9]。因此，本研究利用國家柑橘種質資源圃（重慶）中保存的豐富柚類資源，通過高通量測序技術結合關聯分析和群體遺傳分化分析兩種方式，以挖掘與果肉呈色顯著關聯的變異位點和相關基因，為理解果肉顏色這個復雜的表型性狀提供思路，進一步為分子標記輔助育種和柚果肉顏色改良提供參考?！厩叭搜芯窟M展】果實顏色的形成是一個復雜的生物學過程[10]，包含柚在內的柑橘屬植物，果實著色主要涉及到葉綠素、類胡蘿卜素和花青素3大類，3類色素化合物的成分和比例是決定果實呈色的關鍵指標[11-13]。在柚類品種中，除紫皮柚[14-15]外，鮮有果實在成熟過程中存在花青素沉著現象，絕大多數果實顏色形成受葉綠素和類胡蘿卜素的影響。類胡蘿卜素的合成、降解以及在質體中的儲藏水平均會影響類胡蘿卜素的積累，進而導致不同果肉顏色的呈現[16]。隨著測序技術的不斷發展、測序成本的逐漸降低，對于果實著色的研究已從對合成通路上結構基因的功能解析發展到挖掘更多調控因子。Minamikawa等[17]通過二代測序分析了787份柑橘材料，發現在chr 2、chr 4、chr 6上均存在與果皮和果肉顏色顯著關聯的SNP位點，且與僅有17 kb的距離。王霞[18]利用191份柚類資源對果肉顏色進行了GWAS關聯分析，確定在7號染色體上存在顯著關聯位點?！颈狙芯壳腥朦c】果實顏色代謝相關的調控網絡和關鍵基因有待研究。【擬解決的關鍵問題】通過Fst分析及GWAS關聯分析方法鑒定與柚果肉顏色形成顯著關聯的SNP位點，確定果肉顏色形成的關鍵基因，為柚的品質改良奠定基礎。

1 材料與方法

試驗于2021年5月至2023年2月在西南大學/中國農業科學院柑桔研究所進行，所用100份柚類種質材料均來自于國家柑橘種質資源圃（重慶），材料名稱見表1。

表1 100份柚果肉顏色統計

續表1 Continued table 1

1.1 果肉顏色鑒定

在果實成熟期，每份材料采集3個大小均勻的柚果進行顏色統計并拍照記錄，白色果肉表型記為A，紅色果肉表型記為B。使用colormeter pro手持色差儀測定果實橫切面L（亮度）、a（從紅色至綠色的范圍）、b（從紅色至綠色的范圍）數值，每份材料重復測定3次，每個橫切面重復測定4次。運用飽和度C=(a2+b2)1/2，色差值CI=1000×a/(L×C)對果肉顏色進行評價。

1.2 全基因組測序

將采集的100份柚春梢葉片用75%酒精擦拭干凈，采用改良CTAB法提取基因組DNA，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop ND_1000分光光度計進行DNA濃度和質量檢測。將所有通過質檢的樣品委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行GBS簡化基因組測序。測序得到的原始圖像數據經base calling轉化為序列數據raw data，raw data經fastp軟件質控后比對到柚參考基因組（https:// www.citrusgenomedb.org/analysis/187），采用GATK- HaplotypeCaller和Samtools軟件提取測序結果中的多態性SNP位點，設置dp 5、Miss 0.2、maf 0.01的條件參數進行過濾，最后得到包含100份材料高質量SNP數據的vcf文件用作后續分析。

1.3 主成分分析

用GCTA軟件（http://cnsgenomics.com/software/ gcta/）計算特征值及特征向量進行主成分分析，R軟件中的ggplot2程序包將結果可視化。

1.4 優異變異位點篩選

遺傳分化指數Fst可用于評價群體間的分化程度[19]。將測序得到的vcf文件通過plink軟件轉換為二進制bed文件，根據紅肉柚和白肉柚的表型分組文件逐位點計算群體間的遺傳分化系數Fst，利用R軟件中的ggplot2程序包進行可視化，合理設置閾值，篩選Fst指數較大的位點用于后續分析。

全基因組關聯分析GWAS能夠將表型數據和高通量測序結果關聯分析，從而鑒定與目標性狀相關的變異位點。使用GEMMA軟件（https://gitee. com/khjia/GEMMA）中的GLM模型進行柚果肉顏色關聯分析，根據分析結果合理設置閾值，統計-log10(P)較大的位點并利用qqman程序包繪制manhattan-plot。

1.5 候選基因預測及初步驗證

通過Fst計算結果以及GWAS關聯分析結果兩種方式篩選優異變異位點，將變異位點側翼25 kb序列用柑橘基因組數據庫（https://www.citrusgenomedb. org/）和蛋白質數據庫（https://www.uniprot.org/）進行基因注釋，結合前人研究以及基因功能注釋結果篩選出候選基因。為驗證候選基因與果肉顏色形成的關系，將候選基因的CDS序列上傳到NCBI（https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome）網站進行熒光定量PCR（qPCR）引物設計，引物序列見表2。隨機選擇4份白肉柚（衛寺蜜柚、通賢柚、左氏柚、墊江白柚）和4份紅肉柚（墊江紅心雜種3號、平陽柚、菊花芯柚、江津紅心柚）用作驗證材料。采集果實膨大期（S1）、轉色期（S2）、成熟期（S3）3個時期的柚果，對其顏色參數a、b及色差值CI進行統計，取適量果肉于液氮中充分研磨，用Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取果肉RNA，用Hifair? III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR逆轉錄試劑將RNA逆轉錄成cDNA，用Hieff UNICON? Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix進行熒光定量。選擇為內參基因，用2-△△CT計算候選基因相對表達水平，GraphPad Prism軟件作圖分析。

表2 qPCR相關引物核苷酸序列

2 結果

2.1 果肉顏色鑒定

經過調查統計，100份柚類種質資源中有58份材料為白肉柚，42份材料為紅肉柚。色差測定結果見表3，白肉柚色差指數CI介于-3.27—65.00，顏色變異系數為73.21%；紅肉色差指數CI介于18.37—65.00，顏色變異系數為27.38%。以飽和度C為橫坐標，色差值CI為縱坐標繪制散點圖（圖1），可見白肉群體被聚為一類，紅肉群體聚集為一類。

2.2 主成分分析

經過GBS測序后獲得大量SNP位點，過濾篩選后共得到包含100份材料的121 726個高質量SNP數據。基于過濾后的SNP位點主成分分析結果顯示（圖2），100份材料中紅肉和白肉群體沒有明顯的群體分層現象，表明紅肉和白肉柚類品種群之間并不存在明顯的遺傳差異。若群體之間產生分層，則說明群體間存在太多的遺傳差異，則不利于性狀的關聯分析和基因定位。因而果肉顏色這個數量性狀可以利用100份柚類自然資源群體進行表型和基因型的關聯分析。

2.3 優異變異位點篩選

為挖掘白肉柚與紅肉柚群體果肉顏色的變異情況，根據紅肉柚（58）和白肉柚（42）表型分組用plink軟件進行全基因掃描得到Fst值，閾值設置為0.4。Fst結果顯示（圖3），利用白肉和紅肉兩種表型鑒定到的遺傳分化指數最大位點均分布在chr 7上，且數值達到0.4以上，而已有研究表明Fst指數大于0.25即說明群體間存在明顯分化[19]。這表明白肉柚群體和紅肉柚群體在該位點存在明顯的分化現象，且與果肉顏色性狀高度相關。高于閾值線的6個SNP位點可用于揭示表型性狀的變異關系，詳細信息見表4。

表3 100份柚類種質果肉色差CI變化分布及分布特征

圖1 100份柚類種質的果肉色差值散點圖

圖2 100份柚主成分分析圖

表4 Fst計算獲得的6個SNP位點信息

圖3 白肉柚和紅肉柚群體Fst分析

選用一般線性模型GLM進行GWAS關聯分析，閾值設置為-log10(P)=9。曼哈頓圖（圖4-A）顯示，與果肉顏色關聯的位點共12個（表5），均位于7號染色體上，而Q-Q plot（圖4-B）結果顯示前半部分與觀測值一致，后半部分微微上翹，說明高出期望值的位點可能與果肉顏色相關。

圖4 利用100份柚果肉顏色進行GWAS關聯分析

經過Fst遺傳分化分析以及GWAS全基因組關聯分析兩種方式發現在chr 7上存在Fst＞0.4且-log10(P)＞9的相同變異位點6個，分別是SNP01: 15825706、SNP02: 15987387、SNP03: 15795993、SNP04: 15755408、SNP05: 15744770、SNP06: 16111951。6個SNP在的基因型分別是：A/C、C/T、C/T、C/T、G/A、C/T，其等位分析顯示（圖5），SNP01中基因型為AA的28份材料全部為白肉，基因型為CC的材料中果肉顏色呈紅色的占87%，而基因型為AC的材料有65%果肉為白色；SNP02中基因型為CC和CT的大部分材料果肉顏色為白色，而基因型為TT的紅肉材料有38份，占所有紅肉材料的90%；SNP03基因型中CC基因型只有2份材料為白肉，CT和TT基因型則只有少數材料為紅肉；SNP04中基因型為CT和TT的材料絕大部分果肉為白色，而基因型為CC的材料中，有82%為紅色；SNP05中基因型為GG的材料果肉全部為白色，而GA基因型材料中，95%果肉為白色，AA基因型中有41份材料為紅肉，僅有1份紅肉材料非AA基因型；SNP06中CC基因型材料全部為白色果肉，CT基因型材料中有84%為白肉，TT基因型材料中有39份材料果肉呈紅色，占所有紅肉材料比例的93%。以上結果表明，6個SNP與果肉顏色存在不同程度的關聯，與其關聯的候選基因可能參與果肉顏色形成。

表5 GWAS分析獲得的12個SNP位點信息

圖5 100份柚類種質6個SNP基因型的分析

2.4 候選基因預測及初步驗證

根據類胡蘿卜素合成代謝途徑相關基因的調控研究及變異位點臨近基因的功能注釋信息，篩選到14個基因作為果肉顏色形成的候選基因（表6）。為進一步驗證候選基因是否參與果肉顏色形成，分別選取4個白肉柚材料和4個紅肉柚材料3個發育時期的果實進行熒光定量分析，果肉呈色情況及顏色指數變化分別見圖6和圖7，隨著果實發育成熟，白肉和紅肉果肉顏色差異逐漸明顯，白肉柚在整個發育過程其a值和色差值變化不大，而紅肉柚的a值和色差值隨果肉顏色加深而顯著升高。

表6 14個候選基因注釋信息

將14個基因在柚類果實的不同發育時期進行熒光定量分析（圖8）。在白肉品種總體呈現出先增后減的趨勢，尤其在S2時期表達量較高，而在4個紅肉材料中無明顯表達差異。和隨著果實轉色成熟，大體呈現出先增高后降低的趨勢，在S2及S3時期紅肉材料相對白肉材料平均相對表達更高，在S2時期白肉的‘衛寺蜜柚’和‘左氏柚’的表達量顯著提高。在4個白肉柚中呈現先增高后下降的趨勢，在4個紅肉柚中呈現逐漸降低的趨勢，總體上看，白肉柚材料的表達量相對較高。在S2、S3時期表達量較高，但在兩種果肉表型材料中無明顯表達差異。在S1時期的白肉材料中表達量顯著低于紅肉材料，總體來看，該基因在兩種果肉顏色柚果中無明顯差異。在成熟過程中總體呈現先上升后下降的趨勢，但在兩種顏色果肉材料中表達趨勢無明顯規律。在紅肉品種中的表達量均很低。在白肉材料中表達高于紅肉材料，在S1時期及S3時期差異更顯著。大體呈現先增后減的規律，但在兩種果肉表型材料中的表達趨勢無明顯規律。在試驗材料中均呈現先增后減的表達規律，且在S1、S2、S3三個時期白肉品種的表達量顯著高于紅肉品種。在兩種顏色果肉材料中表達趨勢無明顯規律。在S1時期白肉中的表達量較高于紅肉，但總體來看，在整個發育過程，該基因在兩種材料中無明顯的表達差異。在兩種顏色果肉材料中表達趨勢無明顯規律。綜上，推測、、、、參與果肉顏色形成。

S1：膨大期；S2：轉色期；S3：成熟期。下同 S1: The expansion period; S2: The turning period; S3: The mature period. The same as below

圖7 候選基因驗證所用材料果肉顏色參數變化

每個基因均以‘衛寺蜜柚’S1時期的相對表達量為1。編號所指的品種同表1

The expression level of each gene in Wei Si Honey pomelo S1 period was set as 1. The cultivar indicated by the code is the same as table 1

圖8 14個基因在4個紅肉和4個白肉柚種質果實不同發育時期的相對表達量

Fig. 8 The relative expression of 14 genes in 4 red and 4 white pulp of pomelo accessions at different fruit development stages

3 討論

我國是柚生產和消費的大國，果實品質是柚在市場上競爭的重要因素[20]。果肉顏色不僅是柚重要的外觀品質，也是人們評判其營養價值的重要參考指標[21]。在現有的柚類群體中，產生了眾多紅色果肉的表型變異品種，因其亮麗的顏色和豐富的營養價值受到消費者青睞和育種工作者的關注，因此，豐富果肉顏色對于柚的品種改良具有非常重要的意義。

3.1 群體結構分析

本研究從果肉色差和GBS測序結果分析了100份柚類種質的紅肉和白肉兩種呈色現象，并對其進行了群體結構劃分。根據果肉色差測定結果可見白肉柚和紅肉柚存在明顯的聚類現象；而利用測序得到的SNP標記數據進行主成分分析發現，白肉柚和紅肉柚群體結構較為混雜，沒有明顯的分層現象，可能是本研究所用SNP數據較多，無法將兩個群體顯著地區分。

3.2 變異位點分析

果肉顏色作為一個復雜的品質性狀，受外界條件和遺傳因子綜合作用[22]。盡管果肉呈色的主要色素類胡蘿卜素的代謝通路已非常清晰，但作為一個由多個基因共同決定的性狀，類胡蘿卜素的積累不僅受其結構基因影響，其他激素代謝以及轉錄調控等均有可能影響類胡蘿卜素相關基因的表達進而影響色素的積累[23]。在前人的研究中，利用191份柚共定位了4個SNP位點與果肉顏色相關，其中2號染色體上1個，7號染色體上2個，9號染色體上1個[18]。鄔慶江[24]通過白肉柚和紅肉柚雜交父母本及子代群體對關聯位點進行驗證，但發現經過BSA重測序的結果與王霞的結果無重疊關聯區間?；诖?，利用自然群體對于果肉顏色表型進行關聯位點驗證和候選基因挖掘仍顯得十分重要。本研究通過紅肉和白肉兩種材料共定位到位于7號染色體上的6個SNP位點，與王霞[18]結果基本相符，且在變異位點上游發現直接參與類胡蘿卜素代謝的基因。通過對6個變異位點的等位變異分析發現，這些位點的不同基因型可以用于果肉呈色的判斷。

3.3 候選基因預測

對顯著關聯位點鄰近區域進行注釋后篩選了14個基因作為候選基因，經過基因表達量分析發現，（促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶MAPKKK17）、（膽色素原脫氨酶PBGD）、（轉錄因子TCP7）、（超氧化物歧化酶SOD3）、（FAD合成酶2）5個基因的表達模式與果肉著色存在顯著關聯。MAPKKK17是蛋白質磷酸化信號通路中的重要激酶，參與植物生物和非生物脅迫[25]，研究證明MAPKKK17級聯途徑參與ABA的信號轉導[26]，而類胡蘿卜素的降解產物可作為ABA合成的前體物質[27]，結合定量分析結果，發現MAPKKK17在紅肉材料中較白肉材料高表達，推測其參與了果肉顏色的形成。果肉的呈色由葉綠素和類胡蘿卜素等的含量和成分決定，葉綠素和類胡蘿卜素之間存在相互協調影響的關系[28]，與葉綠素合成、降解相關基因的表達對類胡蘿卜素的積累能產生一定影響[29]。膽色素原脫氨酶PBGD位于葉綠素合成通路上游，是葉綠素合成途徑中的關鍵酶之一[30]。在本研究中，PBGD所編碼的基因在果實成熟過程中的表達量先增后減，且白肉組織中表達量相對紅肉較高，推測其通過控制葉綠素的合成影響了葉綠素與類胡蘿卜素的占比關系進而影響到果實著色。TCP轉錄因子是一類參與植物眾多生長發育過程的轉錄因子，前人發現參與柑橘果實成熟過程，超表達番茄植株較野生型植株轉色提前[31-32]。本研究中，在白肉材料中較紅肉材料高表達，初步判斷其參與了果實著色過程。超氧化物歧化酶具有抗氧化作用，研究表明，擬南芥中SOD2和SOD3可充當葉綠體活性氧消除劑，介導葉綠體的早期發育[33]。在白肉中3個時期較紅肉材料均存在高表達現象，推測其參與了果實顏色的形成。FAD還原酶涉及到植物體內多種氧化還原反應，而研究證明FAD作為CRISTO、LCYB、LCYE、ZEP等多種酶的輔助因子，在色素的積累過程中發揮作用，低含量的FAD更有利于果實的著色[33-34]。本研究中，在4個白肉材料中表達量較高，而在紅肉材料中表達量較低，推測其通過影響類胡蘿卜素的積累進而影響果肉顏色。

4 結論

通過GWAS關聯分析以及Fst方式鑒定到6個與果肉顏色顯著關聯的SNP位點，通過基因表達量分析篩選到5個與呈色有關的基因，分別是（促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶MAPKKK17）、（膽色素原脫氨酶PBGD）、（轉錄因子TCP7）、（超氧化物歧化酶SOD3）、（FAD合成酶2），初步推測這些基因參與了柚果肉顏色的形成。

[1] YAN J, LIU J, XIONG Y B, QIN W, TANG C. Identification of the geographical origins of pomelos using multielement fingerprinting. Journal of Food Science, 2015, 80(2): C228-C233.

[2] 張太平, 彭少麟. 柚的起源、演化及分布初探. 生態學雜志, 2000, 19(5): 58-61, 66.

ZHANG T P, PENG S L. Introduction to the origin and evolution of pomelo and ItsDistribution in China. Chinese Journal of Ecology, 2000, 19(5): 58-61, 66. (in Chinese)

[3] JIANG Q H, YE J L, ZHU K J, WU F F, CHAI L J, XU Q, DENG X X. Transcriptome and co-expression network analyses provide insights into fruit shading that enhances carotenoid accumulation in pomelo (). Horticultural Plant Journal, 2022, 8(4): 423-434.

[4] KATO M, IKOMA Y, MATSUMOTO H, SUGIURA M, HYODO H, YANO M. Accumulation of carotenoids and expression of carotenoid biosynthetic genes during maturation in citrus fruit. Plant Physiology, 2004, 134(2): 824-837.

[5] 張太平, 彭少麟, 王崢峰, 陳碧琛. 柚類種質資源研究與保護概況. 生態科學, 2001, 20(3): 8-13.

ZHANG T P, PENG S L, WANG Z F, CHEN B C. Introduction to the study and protection of pomelo germplasm. Eological Science, 2001, 20(3): 8-13. (in Chinese)

[6] GILL K, KUMAR P, KUMAR A, KAPOOR B, SHARMA R, JOSHI A K. Comprehensive mechanistic insights into the citrus genetics, breeding challenges, biotechnological implications, and omics-based interventions. Tree Genetics & Genomes, 2022, 18(2): 9.

[7] WU G A, PROCHNIK S, JENKINS J, SALSE J, HELLSTEN U, MURAT F, PERRIER X, RUIZ M, SCALABRIN S, TEROL J,. Sequencing of diverse mandarin, pummelo and orange genomes reveals complex history of admixture during citrus domestication. Nature Biotechnology, 2014, 32(7): 656-662.

[8] YU Y, CHEN C X, GMITTER F G. QTL mapping of mandarin () fruit characters using high-throughput SNP markers. Tree Genetics & Genomes, 2016, 12(4): 77.

[9] BERNET G P, FERNANDEZ-RIBACOBA J, CARBONELL E A, ASINS M J. Comparative genome-wide segregation analysis and map construction using a reciprocal cross design to facilitate citrus germplasm utilization. Molecular Breeding, 2010, 25(4): 659-673.

[10] MA G, ZHANG L C, KATO M. Molecular regulation of carotenoid biosynthesis in citrus juice sacs: New advances. Scientia Horticulturae, 2023, 309: 111629.

[11] FUJII H, NONAKA K, MINAMIKAWA M F, ENDO T, SUGIYAMA A, HAMAZAKI K, IWATA H, OMURA M, SHIMADA T. Allelic composition of carotenoid metabolic genes in 13 founders influences carotenoid composition in juice sac tissues of fruits among Japanese citrus breeding population. PLoS ONE, 2021, 16(2): e0246468.

[12] IKOMA Y, MATSUMOTO H, KATO M. Diversity in the carotenoid profiles and the expression of genes related to carotenoid accumulation among citrus genotypes. Breeding Science, 2016, 66(1): 139-147.

[13] 徐娟. 幾個柑桔產區果實色澤評價及紅肉臍橙(L.cv.Cara cara)果肉呈色機理初探[D]. 武漢: 華中農業大學, 2002.

XU J. Evaluation of fruit color in severalproducing areas and preliminary study on the mechanism of pulp color ofL. cv. Cara cara [D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2002. (in Chinese)

[14] 袁悅. 血橙和紫皮柚果實花青苷積累響應光和低溫的機制研究[D]. 武漢: 華中農業大學, 2019.

YUAN Y. Study on the mechanism of anthocyanin accumulation in blood orange and purple pomelo fruits in response to light and low temperature [D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2019. (in Chinese)

[15] HUANG D, WANG X, TANG Z Z, YUAN Y, XU Y T, HE J X, JIANG X L, PENG S, LI L, BUTELLI E, DENG X X, XU Q. Subfunctionalization of the Ruby2-Ruby1 gene cluster during the domestication of citrus. Nature Plants, 2018, 4(11): 930-941.

[16] SUN T H, TADMOR Y, LI L. Pathways for carotenoid biosynthesis, degradation, and storage. Methods in Molecular Biology, 2020, 2083: 3-23.

[17] MINAMIKAWA M F, NONAKA K, KAMINUMA E, KAJIYA- KANEGAE H, ONOGI A, GOTO S, YOSHIOKA T, IMAI A, HAMADA H, HAYASHI T, MATSUMOTO S, KATAYOSE Y, TOYODA A, FUJIYAMA A, NAKAMURA Y, SHIMIZU T, IWATA H. Genome-wide association study and genomic prediction in citrus: potential of genomics-assisted breeding for fruit quality traits. Scientific Reports, 2017, 7: 4721.

[18] 王霞. 柑橘精細定位平臺構建及其在多胚和色澤芽變研究中的應用[D]. 武漢: 華中農業大學, 2018.

WANG X. Construction of citrus fine positioning platform and its application in the study of multi-embryo and color bud change [D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2018. (in Chinese)

[19] WRIGHT S. The genetical structure of populations. Annals of Eugenics, 1951, 15(4): 323-354.

[20] 周蕊. 我國柚類市場與產業調查分析報告. 農產品市場, 2021(24): 47-49.

ZHOU R. Investigation and analysis report on China’s pomelo market and industry. Agricultural Products Market, 2021(24): 47-49. (in Chinese)

[21] 張亞飛, 彭潔, 朱延松, 楊勝男, 王旭, 趙婉彤, 江東. 柑橘CCD基因家族鑒定及Cc4a對果肉顏色的影響. 中國農業科學, 2020, 53(9): 1874-1889. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2020.09.014.

ZHANG Y F, PENG J, ZHU Y S, YANG S N, WANG X, ZHAO W T, JIANG D. Genome wide identification of CCD gene family inand effect ofon the color offlesh. Scientia Agricultura Sinica, 2020, 53(9): 1874-1889. doi: 10.3864/j.issn.0578- 1752.2020.09.014. (in Chinese)

[22] LADO J, ALóS E, MANZI M, CRONJE P J R, GóMEZ-CADENAS A, RODRIGO M J, ZACARíAS L. Light regulation of carotenoid biosynthesis in the peel of mandarin and sweet orange fruits. Frontiers in Plant Science, 2019, 10: 1288.

[23] LU P J, WANG S S, GRIERSON D, XU C J. Transcriptomic changes triggered by carotenoid biosynthesis inhibitors and role ofphosphate transporter 4;2 (CsPHT4;2) in enhancing carotenoid accumulation. Planta, 2019, 249(1): 257-270.

[24] 鄔慶江. 柚果肉色澤和果形調控基因的克隆與鑒定[D]. 武漢: 華中農業大學, 2021.

WU Q J. Cloning and identification of genes regulating flesh color and fruit shape in pummelo [D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2021. (in Chinese)

[25] ROMERO-HERNANDEZ G, MARTINEZ M. Opposite roles of MAPKKK17 and MAPKKK21 againstin. Frontiers in Plant Science, 2022, 13: 1038866.

[26] DANQUAH A, DE ZéLICOURT A, BOUDSOCQ M, NEUBAUER J, FREI DIT FREY N, LEONHARDT N, PATEYRON S, GWINNER F, TAMBY J P, ORTIZ-MASIA D, MARCOTE M J, HIRT H, COLCOMBET J. Identification and characterization of an ABA- activated MAP kinase cascade in. The Plant Journal, 2015, 82(2): 232-244.

[27] TAN B C, JOSEPH L M, DENG W T, LIU L J, LI Q B, CLINE K, MCCARTY D R. Molecular characterization of the9-cis epoxycarotenoid dioxygenase gene family. The Plant Journal, 2003, 35(1): 44-56.

[28] XIE J, YAO S X, MING J, DENG L L, ZENG K F. Variations in chlorophyll and carotenoid contents and expression of genes involved in pigment metabolism response to oleocellosis in citrus fruits. Food Chemistry, 2019, 272: 49-57.

[29] YUAN H, ZHANG J X, NAGESWARAN D, LI L. Carotenoid metabolism and regulation in horticultural crops. Horticulture Research, 2015, 2: 15036.

[30] LIM S H, WITTY M, WALLACE-COOK A D M, ILAG L I, SMITH A G. Porphobilinogen deaminase is encoded by a single gene inand is targeted to the chloroplasts. Plant Molecular Biology, 1994, 26(3): 863-872.

[31] LIN Y F, CHEN Y Y, HSIAO Y Y, SHEN C Y, HSU J L, YEH C M, MITSUDA N, OHME-TAKAGI M, LIU Z J, TSAI W C. Genome-wide identification and characterization ofgenes involved in ovule development of. Journal of Experimental Botany, 2016, 67(17): 5051-5066.

[32] 周延培. 柑橘TCP家族生物信息學分析及CsTCP1轉錄因子參與果實成熟的功能驗證 [D]. 武漢: 華中農業大學, 2016.

ZHOU Y P. Bioinformatics analysis ofTCP family and functional verification of CsTCP1 transcription factor involved in fruit ripening [D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2016. (in Chinese)

[33] BYCHKOV I A, ANDREEVA A A, KUDRYAKOVA N, POJIDAEVA E S, KUSNETSOV V V. The role of PAP4/FSD3 and PAP9/FSD2 in heat stress responses of chloroplast genes. Plant Science, 2022, 322: 111359.

[34] YU Q J, SCHAUB P, GHISLA S, AL-BABILI S, KRIEGER- LISZKAY A, BEYER P. The lycopene cyclase CrtY from(formerly) catalyzes and FADred- dependent non-redox reaction. Journal of Biological Chemistry, 2010, 285(16): 12109-12120.

Genetic Variation Analysis and Candidate Genes Mining of Regulating Flesh Color in Pomelo

CHENG Li, YANG ShengNan, ZHU YanSong, WANG Xu, ZHAO WanTong, LI RenJing, LI Pei, YUAN ZhongJie, JIANG Dong

Citrus Research Institute of Southwest University, Chongqing 400712

【Objective】The flesh color is an important appearance and quality trait of pomelo varieties. The aim of this study was to excavate variation loci and genes significantly related to the flesh color of pomelo varieties, so as to lay a foundation for further understanding the flesh color development mechanism and marker-assisted breeding of pomelo varieties. 【Method】100 pomelo accessions were used to identify their flesh color with a color difference meter, and classified based on their phenotype results. The simplified genome sequencing of 100 pomelo accessions was carried out using GBS (genotyping-by-sequencing) technology. The eigenvalues and eigenvectors of the genotype data obtained from sequencing were calculated by GCTA software to analyze the population structure, and the genetic differentiation index (Fst) of two different flesh color populations were calculated using Plink 2.0 software. The GLM model in GEMMA software was adopted to perform genome-wide association analysis, and the variation loci significantly associated with color phenotype were identified for further allelic variation analysis. According to the citrus linkage disequilibrium (LD) distance, the candidate genes located in the 25 kb adjacent region around the variation loci that might be related to the forming of flesh color were screened out, four white and four red pomelo accessions were randomly selected to perform qPCR to obtain the candidate genes expression at different fruit development stages. 【Result】According to the phenotype of flesh color, 100 accessions were divided into two categories corresponding to white and red pomelo accessions, including 58 white flesh pomelos and 42 red flesh pomelos. Six SNP sites with Fstindex greater than 0.4 and -log10(P)＞9 were screened out after Fst genetic differentiation analysis and GWAS genome-wide association analysis. The genotypes of six variation SNPs sites were extracted from 100 pomelos accessions and the genotypes of these SNPs could be used to predict the flesh color of pomelos. A total of 14 genes that function annotated as isoprene synthesis, plastid development, abscisic acid signal regulation, ethylene response related genes and transcription factors were screened and selected. Genes expression analysis showed that(mitogen-activated protein kinase kinase MAPKKK17),(chloroplast porphyrinogen deaminase),(transcription factor TCP7),(chloroplast superoxide dismutase SOD3),(FAD synthetase 2) were related to the forming of flesh color in pomelos. 【Conclusion】 A total of 6 SNP sites significantly associated with flesh color in pomelos accessions were identified by GWAS and Fst analysis. A total of 14 genes within the 25 kb regions around the mutation SNPs site were screened and annotated. The gene expression analysis showed that five genes might be involved in the forming of flesh color in pomelo accessions.

pomelo; flesh color; Fst; GWAS; candidate genes

2023-02-13；

2023-05-17

國家科技重點研發項目（2019YFD1001400）、柑橘種質資源精準鑒定項目（19211142）、西南大學實驗技術研究項目（SYJ2023021）

程莉，E-mail：chengliak@163.com。通信作者江東，E-mail：jiangdong@cric.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.17.015

（責任編輯 趙伶俐）