高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜用于食品中9 種甜味劑的分析

楊天明，葉磊海，鐘世歡，黃 南，陸梅陽，徐聰玲，蘇 敏，項睿潔，王 輝

（浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州 310009）

隨著越來越多的食品種類的出現(xiàn)，高甜度、低熱量的各種甜味劑在食品添加劑中的作用也越來越大。天然甜味劑在人體使用后基本無明顯毒副作用，而人工合成甜味劑由于主要通過各種化學(xué)反應(yīng)來合成的磺胺類甜味劑、二肽類甜味劑和蔗糖衍生物類甜味劑，其使用成本更低、甜度更高，所以部分食品加工廠家會使用人工合成甜味劑來調(diào)整食品的口味，由于不易被人體代謝吸收，食用多了會增加肝臟的負(fù)擔(dān)和損傷神經(jīng)系統(tǒng)。我國發(fā)布的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中如今已經(jīng)明確規(guī)定了各類甜味劑的使用范圍[1]。

現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)對食品中甜蜜素（環(huán)已基氨基磺酸鈉）、糖精鈉、三氯蔗糖、安賽蜜、紐甜、阿斯巴甜、阿力甜、甜菊糖苷和甜菊雙糖苷9 種甜味劑的檢測方法比較少，目前的現(xiàn)有檢測方法主要以單項目標(biāo)物高效液相色譜法為主[2-9]。由于9 種甜味劑每個方法檢測條件都有所不同，如果同時使用高效液相色譜法進(jìn)行檢測的話，雜峰的干擾會很大，出現(xiàn)各個目標(biāo)物無法進(jìn)行分離，從而無法做到用同一個高效液相色譜法來檢測9 種甜味劑。

試驗建立了采用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法同時測定食品中的9 種甜味劑的方法[12-20]。與現(xiàn)有的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法相比較，該方法操作簡單、高效，具有分辨率高、分離度好、高靈敏度等優(yōu)點，可對食品中9 種甜味劑進(jìn)行確證，提高了樣品的檢測效率。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 型超高效液相色譜-6495 三重四極桿質(zhì)譜儀，美國Agilent 公司產(chǎn)品；QUINTIX65 型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；AR2140型電子分析天平，常州奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品；KS-300EI 型超聲波清洗器，寧波海曙科生超聲設(shè)備公司產(chǎn)品；Milli-Q 型純水儀，美國Millpore 公司產(chǎn)品。

乙腈，色譜純；甲酸，色譜純；甜蜜素（環(huán)已基氨基磺酸鈉）、糖精鈉、三氯蔗糖、紐甜、安賽蜜、阿斯巴甜、阿力甜、甜菊糖苷、甜菊雙糖苷9 種標(biāo)準(zhǔn)品，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供（純度均大于99.0%）。

1.2 試驗條件

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取上述標(biāo)準(zhǔn)品用超純水溶解，分別配制為質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4 ℃避光環(huán)境下保存。分別量取甜蜜素（環(huán)已基氨基磺酸鈉）、紐甜、糖精鈉、阿斯巴甜、阿力甜、安賽蜜各1.0 mL加入到100 mL 容量瓶中，用純化水定容到刻度，配制成為質(zhì)量濃度1 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)中間液混標(biāo)，分別量取甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、三氯蔗糖各1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用純化水定容到刻度，配制成為質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)中間液混標(biāo)。分別量取適量于10.00 mL 容量瓶中，用純化水定容到刻度，配制成甜蜜素（環(huán)已基氨基磺酸鈉）、紐甜、糖精鈉、阿斯巴甜、阿力甜、安賽蜜質(zhì)量濃度為10.0～200.0 ng/mL，三氯蔗糖、甜菊糖苷、甜菊雙糖苷質(zhì)量濃度為20.0～2 000.0 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取飲料、八寶粥和面包樣品2 g（精確至0.01 mg）至50.00 mL 容量瓶中，加純化水30.0 mL，超聲儀超聲提取30 min，定容至刻度，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后供LC/MS 檢測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱，4.6 mm×150 mm，3.5 μm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL，流動相A：0.2%甲酸水溶液，流動相B：純乙腈，流速0.25 mL/min。

液相色譜梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件 / %

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+-）；檢測方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（MRM）。

9 種甜味劑的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

氣簾氣壓力25 psi，碰撞氣流6 mL/min，離子化電壓-4 500 V，離子源溫度500 ℃，霧化器壓力50 psi，輔助氣壓力50 psi，入口電壓-10.0 V，出口電壓-10.0 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取程度

分別對陰性空白樣品飲料、八寶粥、面包3 類樣品進(jìn)行加標(biāo)，取樣量為2 g 分別于10，25，50，100 mL 容量瓶中，分別加純化水5，15，30，60 mL，渦旋1 min，超聲波提取30 min，定容至刻度，搖勻，轉(zhuǎn)移到50 mL 離心管中，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心后過0.22 μm 微孔濾膜后上機(jī)進(jìn)樣。比較不同定容體積下的提取程度。結(jié)果表明，飲料在不同定容體積下對9 種甜味劑的提取程度基本一致；八寶粥和面包在50 mL 定容體積下的提取程度最高，故最終樣品選擇使用50 mL 容量瓶進(jìn)行定容提取。

2.2 色譜柱的優(yōu)化

選擇了實驗室中現(xiàn)有的Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）和WATERS Xbridge shield RPC18柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）2 種色譜柱對9 種甜味劑的分離效果。結(jié)果表明，當(dāng)使用Agilent ZORBAX SB-C18柱時，甜菊雙糖苷、甜菊糖苷和紐甜3 種甜味劑的分離度較差。而使用WATERS Xbridge shield RPC18柱時，三氯蔗糖、阿力甜、紐甜、甜菊雙糖苷和甜菊糖苷5 種甜味劑的分離度較差。對比試驗結(jié)果，最終選擇使用Agilent ZORBAX SB-C18柱。

采用Agilent ZORBAX SB-C18柱總離子色譜圖見圖1，采用WATERS Xbridge shield RPC18柱總離子色譜圖見圖2。

圖1 采用Agilent ZORBAX SB-C18 柱總離子色譜圖

圖2 采用WATERS Xbridge shield RPC18 柱總離子色譜圖

2.3 流動相的選擇

對流動相的選擇也進(jìn)行了考查，首先在有機(jī)相的選擇中發(fā)現(xiàn)乙腈比甲醇對甜味劑的響應(yīng)靈敏度更高。其次分別考查了采用乙腈-純化水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液和乙腈-0.2%甲酸水時對9 種甜味劑的分離效果和靈敏度。采用純乙腈-5 mmol/L 乙酸銨水溶液時，9 種甜味劑的色譜峰較寬，而且部分峰型存在拖尾情況，甜菊糖苷、甜菊雙糖苷和紐甜3 種甜味劑的分離效果一般，其余6 種甜味劑的分離度和色譜峰的情況較好；采用乙腈-純化水時，9 種甜味劑的分離度較差，只出現(xiàn)了3 組峰型重合在一起；而采用乙腈-0.2%甲酸水時，9 種甜味劑的色譜峰峰型和分離度比較乙腈-5 mmol/L 乙酸銨水溶液時更好。故試驗最終選擇乙腈-0.2%甲酸水為流動相。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

比較了9 種甜味劑在正離子和負(fù)離子的模式下的響應(yīng)值，最終選擇除甜蜜素之外的8 種甜味劑為負(fù)離子模式，而甜蜜素選擇正負(fù)離子同時進(jìn)行掃描的模式。首先對9 種甜味劑進(jìn)行了一級質(zhì)譜分析，得到了9 種甜味劑的母離子質(zhì)量數(shù)，并且對去簇電壓進(jìn)行優(yōu)化，保證了母離子的傳輸效率；將母離子進(jìn)行碰撞后，對9 種甜味劑進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，得到9 種甜味劑子離子質(zhì)譜圖，對碰撞能進(jìn)行了優(yōu)化，在多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下對優(yōu)化好的去簇電壓和碰撞能進(jìn)行測試，并在此過程中不斷優(yōu)化毛細(xì)管電壓、干燥器溫度、霧化器的壓力和流速等質(zhì)譜參數(shù)，使離子化效率達(dá)到最佳值。

MRM 多反應(yīng)監(jiān)測模式下各離子色譜圖見圖3。

圖3 MRM 多反應(yīng)監(jiān)測模式下各離子色譜圖

2.5 線性關(guān)系和檢出限的考查

在所優(yōu)化的色譜條件和質(zhì)譜條件下，以優(yōu)化后的流動相對9 種甜味劑進(jìn)行測定，用陰性樣品的空白基質(zhì)配制成一系列適度濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以目標(biāo)物質(zhì)量濃度結(jié)果為橫坐標(biāo)（X），對應(yīng)響應(yīng)值結(jié)果為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，通過向陰性空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)物來考查方法的檢出限（S/N=3）、定量限（S/N=10）、線性回歸方程、線性關(guān)系、檢出限、定量限和線性范圍。

9 種甜味劑的線性方程和相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 9 種甜味劑的線性方程和相關(guān)系數(shù)

2.6 方法回收率和精密度驗證

分別對飲料、八寶粥和面包陰性空白樣品分別進(jìn)行3 個質(zhì)量濃度6 次加標(biāo)回收試驗考查回收率和精密度，在線性范圍內(nèi)，分別選擇0.50，1.00，3.00 mg/kg 和1.00，2.00，6.00 mg/kg 進(jìn)行添加回收試驗，最終得到該方法的方法回收率和精密度。

食品中9 種甜味劑的回收率和精密度見表4。

表4 食品中9 種甜味劑的回收率和精密度

3 個質(zhì)量濃度水平下9 種甜味劑在飲料、八寶粥和面包中的平均加標(biāo)回收率為81.4%～105.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～4.1%。該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

2.7 實際樣品的測定

選取了市售的不同品牌的飲料、八寶粥和面包各10 批進(jìn)行9 種甜味劑的測定，發(fā)現(xiàn)10 批飲料中有6 批含有安賽蜜，10 批八寶粥有9 批含有安賽蜜，含量均在0.30 g/kg 標(biāo)準(zhǔn)值以下；10 批飲料中有5 批含有阿斯巴甜，含量均在0.60 g/kg 標(biāo)準(zhǔn)值以下；10 批飲料中有5 批含有三氯蔗糖，10 批八寶粥有8 批含有三氯蔗糖，含量均在0.25 g/kg 標(biāo)準(zhǔn)值以下，其余甜味劑均未檢出，可以與標(biāo)簽的配料表上所標(biāo)識的配料匹配。面包中均未檢出9 種甜味劑。

3 結(jié)論

建立了高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法同時測定食品中甜蜜素（環(huán)已基氨基磺酸鈉）、三氯蔗糖、阿力甜、安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、甜菊糖苷、紐甜、甜菊雙糖苷9 種甜味劑的檢測方法。樣品通過超純水超聲提取，在正負(fù)離子MRM 模式下分析定量。在甜蜜素（環(huán)已基氨基磺酸鈉）、阿力甜、糖精鈉、紐甜、安賽蜜、阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為10.0～200.0 ng/mL，三氯蔗糖、甜菊糖苷、甜菊雙糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為20.0～2 000.0 ng/mL 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，在飲料、八寶粥和面包不同陰性樣品基質(zhì)中0.50，1.00，3.00 mg/kg和1.00，2.00，6.00 mg/kg 質(zhì)量濃度水平下9 種甜味劑的平均加標(biāo)回收率為81.4%～105.3%，RSD 為1.2%～4.1%。經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法具備前處理易操作、檢測周期短、重現(xiàn)性好、靈敏度高、成本低等優(yōu)點，最終結(jié)果可靠，適用于食品中9 種甜味劑的快速篩查和定量測定，并可應(yīng)用于實際工作中。