復合酶解法制備海帶浸提液的提取工藝研究

鄧加聰，林丹茹，陳 林， 鄭 虹

（1.福建技術師范學院食品與生物工程學院，福建福清 350300；2.福建世紀東潤食品科技有限公司，福建福州 350200）

海帶是一種海洋巨藻，具有很高的營養價值，富含碘、海藻酸、海帶多糖、甘露醇、蛋白質、粗纖維、各種微生素及微量元素等對人體身體有益的功能性成分[1-3]。目前，常見的海帶加工食品有鹽漬海帶、即食海帶涼菜、海帶干和海帶結等[4-7]。

甘露醇在醫療上可作為利尿劑和脫水劑，用于治療腦積水、動脈硬化、高血壓等疾病，還可作為治療冠心病的特效藥[8-11]；海藻酸鈉鹽在醫療上，可用于預防白血病和骨痛病，除此之外還作為穩定劑、增稠劑和乳化劑廣泛應用于牙膏、冰激凌等行業中[12-14]；海帶多糖是目前研究較多的一種成分，從海帶中分離出的海帶多糖具有增強免疫力、抗癌和防癌等功效，同時在抗凝血、抗病毒、減肥、降血糖和降血脂等方面具有顯著功效[15-17]。海帶不僅味美，而且其提取產物在醫藥、化工和食品行業中都有很大用處，海帶都有廣闊的應用前景[18-19]。

目前，海帶中有效產物提取方法主要有水提法、微波提取法、超聲波提取法、酸提取法、酶提取法等[20-23]。與常規提取法相比，酶解法具有提取率高、條件溫和等優點，但是成本較高，因此研究一種高效、低成本的酶解法是目前研究熱點[24-25]。

采用復合酶法制備海帶浸提液，探究其最佳制備工藝條件，旨在為海帶浸提液的制備研究提供新方法、新思路，為海帶浸提液的實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

木瓜蛋白酶（酶活力105U/g）、果膠酶（酶活力105U/g）、蛋白酶（酶活力105U/g），河南正邦實業有限公司提供；干海帶，霞浦溢源海洋食品開發有限公司提供；水楊酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、葡萄糖、硫酸、苯酚、甘露醇等試劑均為分析純，國藥試劑有限公司提供。

1.1.2 儀器與設備

THZ-C 型臺式恒溫振蕩器，江蘇太倉科技有限公司產品；XL-06A 型多功能粉碎機，廣州市旭朗機械設備有限公司產品；BSA224S 型電子分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司產品；UV-2100 型紫外可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司產品；PHS-3C 型酸度計，上海赫爾普國際貿易有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同酶類及酶添加量對海帶浸提液制備的影響

分別選用纖維素酶（0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%）、果膠酶（0，0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%）、木瓜蛋白酶（0，0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%）3 種酶對海帶粉進行酶解，酶解反應初始條件為料液比1∶30（g∶mL），海帶粉用量2 g，酶解液pH 值5.5，酶解溫度55 ℃，酶解時間60 min 后，于100 ℃水浴中滅酶10 min，以轉速4 000 r/min 離心10 min，測定海帶浸提液中甘露醇、海藻酸及多糖的含量。

1.2.2 復合酶添加量對海帶浸提液制備的影響

將纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶按8∶2∶3比例進行混勻，配成復合酶。酶解反應初始條件為取海帶粉用量2 g，按料液比1∶30（g∶mL），加入一定量的復合酶（0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%），酶解液pH 值5.5，酶解溫度55 ℃，酶解時間60 min 后，于100 ℃水浴中滅酶10 min，以轉速4 000 r/min 離心10 min，測定海帶浸提液中甘露醇、海藻酸及多糖的含量。

1.2.3 酶解時間對海帶浸提液制備的影響

取2 g 海帶粉加入蒸餾水60 mL，將酶解液pH值調至5.5，加入1.5%復合酶，于55 ℃下酶解一定時間（30，60，120，180，240 min），測定海帶浸提液中甘露醇、海藻酸及多糖的含量。

1.2.4 酶解溫度對海帶浸提液制備的影響

取2 g 海帶粉加入蒸餾水60 mL，將酶解液pH值調至5.5，加入1.5%復合酶，于不同溫度（35，40，45，50，55，60 ℃）下酶解90 min，測定海帶浸提液中甘露醇、海藻酸及多糖的含量。

1.2.5 料液比對海帶浸提液制備的影響

取2 g 海帶粉分別加入不同量的蒸餾水（使料液比控制在1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45），酶解液pH 值調至5.5，加入1.5%復合酶，于55 ℃下酶解90 min，測定海帶浸提液中甘露醇、海藻酸及多糖的含量。

1.2.6 正交試驗設計對海帶浸提液制備的影響

在單因素試驗的基礎上，選取酶解溫度、料液比、酶解時間和復合酶添加量4 個因素，采用四因素三水平的正交試驗設計，對海帶浸提液制備的影響進行探討。

正交試驗設計因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗設計因素與水平設計

1.2.7 海帶浸提液中甘露醇的測定采用分光光度計法測定海帶浸提液中甘露醇提取量[26]。

式中：C——海帶浸提液的甘露醇質量濃度，mg/L；

V——測定取樣體積，mL；

F——測定樣品稀釋倍數；

m——稱取海帶粉質量，g。

1.2.8 海帶浸提液中海藻酸的測定

采用分光光度計法測定海帶浸提液中海藻酸提取量[27]。

式中：C——海帶浸提液的海藻酸質量濃度，mg/L；

V——測定取樣體積，mL；

F——測定樣品稀釋倍數；

m——稱取海帶粉質量，g。

1.2.9 海帶浸提液中多糖的測定

采用硫酸-苯酚法測定海帶浸提液中多糖提取量[28]。

式中：C——海帶浸提液的多糖質量濃度，mg/L；

V——測定取樣體積，mL；

F——測定樣品稀釋倍數；

m——稱取海帶粉質量，g。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗對海帶浸提效果的影響

2.1.1 不同酶種類及酶用量對海帶浸提效果的影響

不同酶類及添加量對海帶浸提效果的影響見圖1。

圖1 不同酶類及添加量對海帶浸提效果的影響

由圖1（a）可知，當纖維素酶添加量為2%時，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖提取量均達到最大值，因此纖維素酶的最佳添加量為2%；由圖1（b）可知，當果膠酶添加量為0.5%時，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖提取量均達到最大值，因此果膠酶的最佳添加量為0.5%；由圖1（c）可知，當木瓜蛋白酶添加量為0.75%時，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖提取量均達到最大值，因此木瓜蛋白酶的最佳添加量為0.75%。以上酶添加量單因素試驗可得，纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的最佳配比為8∶2∶3。

2.1.2 復合酶添加量對海帶浸提效果的影響

復合酶添加量對海帶浸提效果的影響見圖2。

圖2 復合酶添加量對海帶浸提效果的影響

由圖2 可知，隨著復合酶添加量的增加，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖提取率也逐漸增加，當復合酶添加量為1.5%時，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖提取率達到最高。因此，復合酶的添加量為1.5%。

2.1.3 料液比對海帶浸提效果的影響

料液比對海帶浸提效果的影響見圖3。

圖3 料液比對海帶浸提效果的影響

由圖3 可知，海帶的海藻酸、甘露醇和多糖的提取量隨著料液比的增大呈先增后降的趨勢；當料液比為1∶35 時，海帶的海藻酸、甘露醇和有機質的提取量均達到最大，此時提取量分別為260.00，258.80，147.72 mg/g。綜上所述，選擇1∶35 為最佳料液比。

2.1.4 酶解溫度對海帶浸提效果的影響

酶解溫度對海帶浸提效果的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對海帶浸提效果的影響

由圖4 可知，過高或過低的酶解溫度，都不利于復合酶對海帶的酶解，從而影響提取效果。當酶解溫度為55 ℃時，海藻酸、甘露醇和多糖的提取量達到最大。因此，選擇55 ℃為最佳酶解溫度。

2.1.5 酶解時間對海帶浸提效果的影響

酶解時間對海帶浸提效果的影響見圖5。

圖5 酶解時間對海帶浸提效果的影響

由圖5 可知，海藻酸、甘露醇和多糖的提取量隨著酶解時間的延長，逐漸增加；當酶解時間為120 min 時，三者得率均達到最大；之后隨著酶解時間的延長，得率不再增加。因此，酶解最佳時間為120 min。

2.2 正交設計對海帶浸提效果的影響

根據單因素試驗結果，選取酶添加量、料液比、酶解溫度和酶解時間對海帶浸提效果進行正交設計試驗，以浸提液中的甘露醇、海藻酸、多糖提取量為考查指標。

海帶提取的正交試驗結果見表2。

表2 海帶提取的正交試驗結果

由表2 可知，各因素對海帶浸提液中甘露醇和多糖提取量的影響最顯著的是料液比（C），之后依次是酶解時間（A）、酶解溫度（B）和復合酶添加量（D）；而對海藻酸提取量的影響最顯著的是酶解時間（A），之后依次是酶解溫度（B）、料液比（C）和復合酶添加量（D）。甘露醇、海藻酸和多糖的最佳浸提組合分別是A1B2C2D2、A1B1C2D2、A1B2C3D2。為了更好地確定海帶的最佳浸提條件，對3 種組合進行驗證性試驗。

驗證性試驗見表3。

表3 驗證性試驗 /mg·g-1

由表3 可知，對甘露醇、海藻酸及多糖含量較高的組合進行驗證試驗，可確定最佳組合為A1B2C2D2，即復合酶添加量為1.5%，料液比為1∶35，酶解溫度為55 ℃，酶解時間為90 min，在該酶解條件下，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖的提取量分別為240.19，326.15，126.75 mg/g。

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗對復合酶酶解海帶獲得海帶浸提液的工藝進行研究，得到最佳的酶解工藝為復合酶添加量1.5%，料液比1∶35，酶解溫度55 ℃，酶解時間90 min，在該酶解條件下，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖的提取量分別為240.19，326.15，126.75 mg/g。復合酶對海帶進行酶解，跟傳統的熱水浸提法、酸堿浸提法、單一酶解法等提取方法，具有時間短、提取效率高、反應條件溫和等優點，為今后海帶資源的高值化加工提供更廣闊的前景。