柑橘黃化花葉病毒的實時定量PCR檢測及其在寄主植株中的時空分布規律

曹鵬，許建建，李楚欣，王新亮，王春慶，宋晨虎，宋震

柑橘黃化花葉病毒的實時定量PCR檢測及其在寄主植株中的時空分布規律

曹鵬，許建建，李楚欣，王新亮，王春慶，宋晨虎，宋震

西南大學柑桔研究所/國家柑桔工程技術研究中心，重慶 400712

【背景】柑橘黃化花葉病毒（citrus yellow mosaic virus，CYMV）是首先發現于印度并對其柑橘產業造成嚴重危害的一種桿狀DNA病毒。目前，CYMV已被美國、日本、新西蘭、歐洲和地中海地區列入檢疫性有害生物名單，具有傳入我國的潛在風險。【目的】建立CYMV的實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）檢測體系；篩選CYMV敏感柑橘品種；明確CYMV在寄主植株中的時空分布規律，為該病毒的監控提供技術支持。【方法】根據NCBI中CYMV外殼蛋白（coat protein，CP）基因保守序列，利用軟件Primer Premier 5設計qPCR檢測引物8對，通過常規PCR篩選擴增效果好、特異性強的引物。通過對引物濃度、退火溫度等反應條件優化，建立CYMV的qPCR檢測體系，并進一步通過對不同柑橘病原的檢測評價所建體系的特異性；以梯度稀釋的1.98×109—1.98copies/μL的質粒標準品平行進行常規PCR及qPCR檢測，評價所建方法的靈敏度；隨機采集田間柑橘樣品，平行進行常規PCR及qPCR檢測，評價所建方法的適用性。將CYMV接種到玉環柚（）、強德勒柚（）、22號枳（）等15個柑橘品種，進行癥狀觀察和分子檢測以篩選敏感指示植物。在接種后不同時間，分別自MV甜橙（）植株不同組織部位取樣，以柑橘生長因子1基因為內參基因，利用所建體系進行qPCR檢測，從而明確CYMV在寄主植株中的時空分布規律。【結果】建立了CYMV的qPCR檢測體系，其最佳引物為CYMV-qF7/R7，最佳引物濃度為200 nmol·L-1，最佳退火溫度為63 ℃。該檢測體系的特異性強，檢測靈敏度是常規PCR的1 000倍。對來自不同地區的660個田間柑橘樣品的檢測結果表明，qPCR檢測與常規PCR檢測結果一致，除陽性對照外均未檢測到CYMV陽性植株。不同柑橘品種接種試驗結果表明，15個柑橘品種中，玉環柚和強德勒柚最早表現出強烈的黃化花葉典型侵染癥狀，可以作為敏感指示植物。qPCR檢測結果表明，老葉中的CYMV滴度最高，老皮和根病毒滴度較高，嫩皮中的滴度較低。CYMV在植株中的相對含量，7—9月最高，此后逐月下降，并在次年1月達到最低值，從次年2月開始，CYMV的相對含量開始上升，與環境溫度變化趨勢一致。【結論】建立了特異性強、靈敏度高的CYMV實時熒光定量PCR檢測方法，利用該方法明確了CYMV在寄主植株中的時空分布規律。此外，玉環柚和強德勒柚可作為CYMV敏感指示植物。

柑橘黃化花葉病毒；實時熒光定量PCR；時空分布

0 引言

【研究意義】柑橘黃化花葉病毒（，CYMV）是逆轉錄病毒目（）花椰菜花葉病毒科（）桿狀DNA病毒屬（）的一種dsDNA病毒[1-3]，采用Class VII復制策略[4]。自1975年在印度Anantapur地區發現以來[1]，已經廣泛分布于印度中部和南部地區，并對當地柑橘產業造成了嚴重危害[5]。目前，CYMV已被新西蘭、美國、日本和歐盟等國家和地區列入檢疫管制對象[6-7]，但我國尚未見相關報道。因此，為降低CYMV對我國柑橘產業的生物安全風險，有必要建立CYMV的高效實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）檢測體系；篩選CYMV敏感柑橘品種；明確CYMV在寄主植株中的時空分布規律，從而為該病毒的監控提供技術支持。【前人研究進展】CYMV主要通過嫁接傳播[8]。Ahlawat等[9]對不同柑橘品種進行嫁接傳毒，將其成功傳染到13種柑橘植株上，包括甜橙（）、柚（）、酸橙（）等，但不能傳給墨西哥萊檬（）。CYMV可能通過橘臀紋粉蚧（）傳播[10]，但有待進一步驗證。該病毒引起的寄主典型癥狀為出現花葉和沿葉脈擴散的黃色斑點[11-12]，并導致柑橘果實產量和品質下降[13]，縮短柑橘樹體的生產壽命[14]。目前其檢測方法主要有常規PCR[15-19]、環介導等溫擴增[20]、qPCR[14,21]和核酸特異性雜交[22]等。【本研究切入點】盡管Johnson[21]和Motghare[14]等已建立了CYMV的qPCR檢測方法，但前者的靈敏度仍較低。后者進一步提高了檢測靈敏度，可檢測出2.3×103copies/μL的樣品。不過，這兩種qPCR檢測體系在本實驗室應用的效果不佳。因此，本研究根據NCBI中CYMV外殼蛋白（coat protein，CP）基因保守區域設計引物，期望建立快速、準確且更為靈敏的CYMV qPCR檢測體系，從而更好地應用于CYMV的檢測和監控。【擬解決的關鍵問題】構建快捷、準確的CYMV實時定量PCR檢測方法，明確CYMV在寄主植株中時空分布規律，為田間柑橘黃化花葉病的早期監測和預警提供技術支持和理論依據。

1 材料與方法

試驗于2020—2023年在西南大學柑桔研究所國家苗木脫毒中心實驗室完成。

1.1 材料與試劑

供試柑橘黃龍病菌（Liberibacter asiaticus）、柑橘潰瘍病菌（subsp.）、柑橘褪綠矮縮病毒（citrus chlorotic dwarf-associated virus，CCDaV）、柑橘黃化脈明病毒（citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）、柑橘葉斑駁病毒（citrus leaf blotch virus，CLBV）和CYMV等感染材料，玉環柚、MV甜橙等柑橘品種均保存于西南大學柑桔研究所脫毒中心溫網室。田間葉片樣品于2021年10月采集于湖南、廣西和重慶地區。

1.2 引物設計

根據NCBI中已報道的CYMV保守區域，利用Primer Premier 5軟件設計8對qPCR檢測引物（表1）。用引物CYMV-CP-F/R[23]擴增序列用于構建質粒標準品，根據文獻[14]合成引物EF-1F/R用于內參基因的擴增。各引物均經Primer-BLAST比對，保證引物的特異性，所有引物送重慶擎科公司合成。

表1 本研究使用的引物信息

1.3 核酸提取

依據DNA提取試劑盒（康為世紀，CW0531S）說明書提取感染CYMV、CCDaV、柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌的柑橘葉片總DNA；用RNAiso Plus（TaKaRa，9109）并按照說明書提取感染CLBV、CYVCV柑橘葉片總RNA，按照試劑盒PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2（Takara，RR055A）進行反轉錄獲取cDNA，并使用相應病原特異性引物檢測確認陽性。

1.4 CYMV-CP質粒標準品制備

以1.3中提取的CYMV DNA為模板，CYMV-CP- F/R為上下游擴增引物，使用Primer STAR Max Premix（Takara）進行常規PCR擴增并通過瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根，DP219）回收。將基因序列連接到pCE2 TA/Blunt-Zero載體上，連接產物轉化大腸桿菌DH10B感受態細胞（上海唯地生物），挑選單克隆菌檢，陽性單克隆送重慶擎科測序并比對。使用質粒小提試劑盒（天根，DP103）提取測序結果陽性克隆菌液質粒，測定其濃度計算質粒拷貝數[24]并以10倍梯度稀釋，作為定量的標準品。

1.5 qPCR檢測體系的建立

1.5.1 引物篩選 參照文獻[20]，以不同病原陽性DNA（cDNA）樣品為模板，利用所設計的8對引物分別進行常規PCR，觀察擴增條帶和擴增產物含量，測序比對后，篩選最佳實時引物。

1.5.2 引物濃度的優化 以1.98×108copies/μL的質粒標準品為模板，設定7個引物濃度（10、50、100、150、200、400、1 000 nmol·L-1）進行qPCR，觀察各引物濃度下的擴增效率和熔解曲線。

1.5.3 退火溫度的優化 以1.98×108copies/μL的質粒為模板，退火溫度設置56.3—64.7 ℃，進行qPCR，觀察退火溫度對熒光信號的影響，選取Ct值最小且只具有單一峰值的熔解曲線的溫度作為最優退火溫度。

1.5.4 標準曲線的建立 以1.98×109—1.98 copies/μL的質粒標準品為模板，在優化條件下進行qPCR，設置3個技術重復。反應體系：質粒1 μL，GoTaq? qPCR Master Mix（Promega，A6001）10 μL，CYMV-qF7/R7各1 μL，ddH2O 7 μL。qPCR擴增條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 15 s，63 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40個循環。儀器：德國耶拿qTOWER3G，后期涉及qPCR試驗均在此儀器完成。

1.6 qPCR檢測體系的評價

1.6.1 特異性 分別以柑橘黃龍病菌、柑橘潰瘍病菌、CCDaV、CYVCV、CLBV、CYMV感染植株總DNA（cDNA）為模板，進行qPCR，觀察熔解曲線是否為單一峰。

1.6.2 靈敏度 以梯度稀釋的1.98×109—1.98 copies/μL的質粒標準品為模板，分別進行常規PCR和qPCR，比較兩種方法的檢測靈敏度。

1.6.3 適用性 對來源湖南、廣西和重慶的柑橘葉片樣品，以建立的CYMV qPCR進行檢測。

1.7 敏感指示植物篩選

1.7.1 CYMV接種不同柑橘品種 將感染CYMV的甜橙通過嫁接接種到半年生健康的尤力克檸檬（）、馬水橘（）、3號椪柑（）、22號枳、哈姆林甜橙（）、玉環柚、晚白柚（）、金橙蜜柚（）、大果甜橙（）、威爾金柳葉橘（）、摩洛哥酸橙（）、粗檸檬（）、強德勒柚、鄧肯葡萄柚（）和MV甜橙15種柑橘植株各10株。

1.7.2 癥狀觀察和分子檢測 在嫁接90 dpi時提取不同品種柑橘葉片DNA進行常規PCR檢測；在接種后持續開展癥狀觀察，并于接種后一年取老熟葉片進行qPCR檢測。采用2-ΔΔCt法計算病毒相對含量。

1.8 CYMV在寄主植株中的時空分布規律

利用所建立的CYMV qPCR檢測體系，以作為內參基因，對接種CYMV一年后的MV甜橙植株（保存于隔離網室）進行不同組織部位（根、幼嫩枝皮（嫩皮）、老熟枝皮（老皮）、幼嫩葉片（嫩葉）、老熟葉片（老葉））和相同部位（老葉）周年的病毒相對含量檢測，每組樣品設3個技術重復和3個生物學重復。

2 結果

2.1 qPCR檢測體系的建立

根據保守序列設計實時引物8對，常規PCR檢測結果發現CYMV-qF7/R7只能從CYMV陽性樣品中擴出條帶且擴增條帶單一，擴增產物含量高。測序表明所獲片段與CYMV的序列同源性100%。選其進行后續CYMV qPCR檢測體系的建立。

設置不同引物濃度梯度進行qPCR，結果發現隨著引物濃度的增加，其熒光強度呈先上升后下降的趨勢，引物濃度偏高或偏低都影響反應的效率。當引物濃度在200 nmol·L-1時熒光吸收值最高，且Ct值最小，因此確定其為該體系引物最優濃度（圖1-a）。

設置退火溫度梯度56.3—64.7 ℃進行qPCR，結果表明退火溫度在63 ℃時熒光值最高，Ct值最小且熔解曲線為單一峰（圖1-b），因此確定該體系的退火溫度為63 ℃。

引物CYMV-qF7/R7濃度設為200 nmol·L-1，退火溫度設為63 ℃，構建標準曲線，發現質粒標準品濃度1.98×102—1.98×109copies/μL對數與Ct值呈現良好線性關系，=-3.6073+46.356，相關系數（2）為0.9902，擴增效率為89.3%（圖1-c）。這表明CYMV qPCR檢測體系初步構建成功。

a：不同檢測引物濃度條件下的CYMV qPCR擴增曲線qPCR amplification curve of CYMV with different primer concentrations。b：退火溫度為63 ℃的CYMV qPCR擴增熔解曲線The melting curve of CYMV qPCR at annealing temperature of 63 ℃。c：CYMV的qPCR檢測標準曲線The standard curve of qPCR for CYMV。d：特異性檢測Specific detection。1：CYMV；2：柑橘黃龍病菌Candidatus Liberibacter asiaticus；3：柑橘潰瘍病菌Xanthomonas citrisubsp.citri；4：CCDaV；5：CYVCV；6：CLBV；7：陰性對照Negative control。e：qPCR的CYMV靈敏度檢測CYMV sensitivity detection of qPCR。1—10：1.98×109—1.98copies/μL質粒1.98×109-1.98 copies/μL plasmid；11：ddH2O。f：常規PCR的CYMV靈敏度檢測CYMV sensitivity detection of conventional PCR。M：5 kb Marker；1—10：1.98×109—1.98 copies/μL質粒1.98×109-1.98 copies/μL plasmid；11：H2O

2.2 qPCR檢測體系的評價

2.2.1 特異性 分別以柑橘黃龍病菌、柑橘潰瘍病菌、CYVCV、CCDaV、CLBV和CYMV感染植株葉片總DNA（cDNA）為模板，利用所建立的qPCR體系進行檢測，結果如圖1-d所示，除CYMV外，其他5種病原均無特異性擴增，表明該體系特異性好。

2.2.2 靈敏度 以梯度稀釋的1.98×109—1.98copies/μL的CYMV為模板，分別進行常規PCR和qPCR。結果顯示qPCR能夠檢測到1.98×102copies/μL的質粒濃度（圖1-e），而常規PCR只能檢測到1.98×105copies/μL的質粒濃度（圖1-f），qPCR的靈敏度是常規PCR的1 000倍。

2.2.3 適用性 應用所建立的CYMV qPCR體系，對來自不同地區的田間樣品分別進行常規PCR和qPCR檢測，檢測部位為老熟葉片。qPCR和常規PCR檢測結果一致，除陽性對照外，所有田間樣品均為陰性，表明均暫未在田間檢測到CYMV。在陽性對照樣品中，qPCR的檢出率為100%，常規PCR的檢出率為83.3%（表2）。

表2 不同地區田間柑橘樣品的CYMV檢測

2.3 CYMV敏感指示植物的篩選

2.3.1 CYMV嫁接接種不同柑橘品種的常規PCR檢測 通過嫁接接種CYMV至15個柑橘品種（各10株），在90 dpi提取總核酸進行常規PCR檢測。結果表明尤力克檸檬、22號枳、哈姆林甜橙、玉環柚、晚白柚、金橙蜜柚、威爾金柳葉橘、摩洛哥酸橙、粗檸檬、強德勒柚、鄧肯葡萄柚和MV甜橙的陽性率分別為10%、100%、10%、100%、50%、30%、40%、90%、90%、70%、70%和70%，平均侵染率為60.8%；馬水橘、3號椪柑和大果甜橙的侵染率為0。

2.3.2 CYMV接種后癥狀觀察 在接種后進行持續癥狀觀察，結果顯示玉環柚出現沿葉脈擴散的黃化花葉癥狀（圖2-a、2-b），強德勒柚葉片出現輕微花葉癥狀（圖2-c、2-d），22號枳出現沿葉脈黃化，其余植株無癥或癥狀輕，其中強德勒柚最早出現癥狀，玉環柚出現的癥狀最嚴重，所以玉環柚和強德勒柚可以作為敏感指示植物。

接種一年后對成功侵染的12個柑橘品種進行qPCR檢測，結果顯示出現明顯癥狀的玉環柚和強德勒柚病毒相對含量比其他癥狀不明顯柑橘品種的病毒相對含量低（圖2-e），這表明CYMV病毒的相對含量可能與癥狀強弱無關聯。

2.4 CYMV在MV甜橙中的時空分布

2.4.1 空間分布 2022年9月，在MV甜橙植株不同部位進行取樣和DNA提取，利用所建立的CYMV qPCR檢測體系測定植株中CYMV的相對含量。結果表明CYMV的相對含量在不同組織部位存在較大差異，由高到低依次為老葉、老皮、根、嫩皮、嫩葉（圖3）。

2.4.2 周年分布 2022年7月10日至2023年6月10日，采集MV甜橙的老葉提取DNA后，以為內參基因，用建立的qPCR體系測定CYMV相對含量的周年變化。結果顯示植株老葉中CYMV的相對含量從7月到9月呈上升趨勢，病毒含量較高；10月至次年1月呈顯著下降趨勢，在次年1月達到最低值，并于次年2月開始逐月上升（圖4-a）。病毒相對含量的變化趨勢與重慶2022年7月至2023年6月氣溫（圖4-b，來源于氣象網）變化趨勢基本一致，表明病毒滴度與溫度呈正相關。

a：健康的玉環柚葉片Healthy Yuhuanyou leaf；b：接種CYMV的玉環柚葉片Yuhuanyou leaf inoculated with CYMV；c：健康的強德勒柚葉片Healthy Chandler pomelo leaf；d：接種CYMV的強德勒柚葉片Chandler pomelo leaf inoculated with CYMV；e：12種柑橘接種CYMV后的葉片病毒相對含量Relative content of virus in leaves of 12 citrus varieties inoculated with CYMV。尤力克檸檬C. limon；22號枳P. trifoliata；哈姆林甜橙C. sinensis；玉環柚C. grandis；晚白柚C. maxima；金橙蜜柚C. grandis；威爾金柳葉橘C. reticulata；摩洛哥酸橙C. aurantium；粗檸檬C. limonia；強德勒柚C. grandis；鄧肯葡萄柚C. paradise；MV甜橙C. sinensis

圖3 CYMV在接種MV甜橙后不同組織部位的相對含量

a：CYMV相對含量的周年變化Annual variation of CYMV relative content；b：重慶2022年7月至2023年6月氣溫圖Air temperature in Chongqing from July 2022 to June 2023

3 討論

3.1 CYMV特異性強、靈敏度高的qPCR檢測體系建立

CYMV作為被多個國家和地區列入檢疫名錄的病毒可造成柑橘產量嚴重下降及品質劣變。我國目前尚未有CYMV的報道，因此有必要加強對此病毒的監控，尤其是對來自國外以及邊境地區柑橘種植園的苗木，從而降低該病毒對我國柑橘產業的生物安全風險。近年來，研究者開發了一系列CYMV檢測技術，如常規PCR、ELISA和環介導等溫擴增檢測等[19-20]，但均無法對植株內的病毒滴度進行精確定量，且靈敏度低。qPCR技術作為一種核酸定量的新方法，具有簡便、靈敏度高和特異性強等優點，已在植物病毒檢測和監控中得到了廣泛應用[25-26]。Motghare[14]和Johnson[21]等建立了CYMV的qPCR檢測方法，但Johnson建立的檢測方法能夠檢測出的CYMV質粒標準品最低濃度為1.42×109copies/μL，靈敏度較低，Motghare建立的CYMV qPCR檢測方法靈敏度進一步提高，達到常規PCR的100倍，可檢測出2.3×103copies/μL的樣品。不過，這兩種qPCR檢測體系在本實驗室應用的效果不佳。因此，本研究基于CYMV外殼蛋白基因保守序列設計了特異性引物CYMV-qF7/R7，利用該引物建立的qPCR體系具有較高的特異性，靈敏度達到1.98×102copies/μL，是常規PCR的1 000倍，為更好監測CYMV的發生和流行提供了技術支撐。

應用所建立的CYMV qPCR檢測體系，對來自不同地區的樣品進行qPCR檢測，暫未在田間發現CYMV陽性植株。不過，由于目前檢測的植株數量不足，且只有湖南、廣西和重慶三地樣品，結果缺乏全面性，需進一步對來源不同地區的更多柑橘樣品進行檢測，從而降低CYMV傳入我國并大規模暴發的風險。

3.2 CYMV在甜橙中的時空分布規律

本研究進行了CYMV在寄主體內的周年分布監測，發現2022年9月CYMV的相對含量最高，此后病毒相對含量下降，在2023年2月病毒相對含量又上升，這與同期環境溫度的變化趨勢一致。這可能與植物-病毒相互作用受環境因素的調節，尤其是溫度因素的影響有關[27]。有研究表明，溫度對病毒-寄主相互作用具有不同的影響，其中一種是呈正相關性，如較高溫度可使擬南芥植株中蕪菁皺縮病毒（turnip crinkle virus，TCV）的復制增強[28]；雀麥花葉病毒（brome mosaic virus，BMV）在25 ℃侵染大麥時，主要局限于韌皮部以及相關的細胞中，而在溫度達到34 ℃時BMV可突破韌皮部，造成系統侵染，從而引起植株癥狀加重，植株體內的病毒相對含量增加[29]。另一種則與之相反，溫度升高后病毒積累量降低，寄主癥狀減弱，如葡萄斑點病毒（grapevine fleck virus，GFkV），在7月出現高溫后，其在‘陽光葡萄’中的病毒積累量顯著降低[30]；蕪菁花葉病毒（turnip mosaic virus，TuNV）在侵染本氏煙后進行高溫處理，發現高溫（30 ℃）通過刺激RNA沉默及相關抗逆激素途徑提高了植株對病毒的抗性，致使病毒侵染被抑制[31]。本研究中，CYMV在夏季高溫下的病毒積累量更高，表明溫度與CYMV-寄主相互作用呈正相關，這可能與CYMV來源于熱帶地區有關，但后續還需進一步試驗驗證。

CYMV在甜橙植株中存在分布不均的現象，根和枝皮中病毒含量低于老熟葉片，可能是由于病毒在寄主植株體內的移動和分布與寄主植株營養物質的運輸、合成和貯藏機制關系緊密[32]。對CYMV感病株的不同部位和時期病毒相對含量檢測明確了該病毒在植株中的分布特征，為CYMV的準確檢測與診斷提供了理論依據，可用于指導樣品采集，如優先采取夏季的老熟葉片，有利于達到更好的監測效果。

4 結論

建立了特異性強、靈敏度高的CYMV qPCR檢測體系，明確了CYMV在寄主植株中的時空分布規律，可用于對CYMV的長期監測預警。此外，玉環柚和強德勒柚可作為CYMV敏感指示植物。

[1] Dakshinamurti V, Reddy G S. Mosaic: a transmissible disorder of sweet oranges. Indian Phytopathology, 1975, 28: 398-399.

[2] Pringle C R. The universal system of virus taxonomy of the International Committee on Virus Taxonomy (ICTV), including new proposals ratified since publication of the sixth ICTV report in 1995. Archives of virology, 1998, 143(1): 203-210.

[3] Huang Q, Hartung J S. Cloning and sequence analysis of an infectious clone of citrus yellow mosaic virus that can infect sweet orange via-mediated inoculation. The Journal of general virology, 2001, 82(10): 2549-2558.

[4] Mason W S, Taylor J M, Hull R. Retroid virus genome replication//Advances in Virus Research. Amsterdam: Elsevier, 1987: 35-96.

[5] Ahlawat Y S. Citrus decline: problems and prevention. Indian Phytopathology, 2007, 60: 1-12.

[6] JOHNSON A M, GOPAL D V R, Sudhakar C, Dasgupta I. Citrus yellow mosaic badnavirus infectingsp.: a threat to the citrus industry and a quarantine issue. Journal of General Plant Pathology, 2017, 83(2): 57-65.

[7] European Food Safety Authority. Pest risk assessment made by France on citrus yellow mosaic virus or citrus mosaic badnavirus considered by France as harmful in the French overseas departments of French Guiana, Guadeloupe, Martinique and Réunion - Scientific opinion of the panel on plant health. The EFSA Journal, 2008, 6(5): 686.

[8] Dakshinamurti V. Investigations on mosaic virus disease of Sathgudi ((L) Osb) in Andhra Pradesh[D]. Tirupati, India: Sri Venkateswara University, 1981.

[9] Ahlawat Y S, Pant R P, Lockhart B E L, Srivastava M, Chakraborty N K, Varma A. Association of a badnavirus with citrus mosaic disease in India. Plant disease, 1996, 80(5): 590-592.

[10] Bhat A I, Hohn T, Selvarajan R. Badnaviruses: the current global scenario. Viruses, 2016, 8(6): 177.

[11] Baranwal V K, Sharma S K. Emergence and diversity of badnaviruses in India//A Century of Plant Virology in India. Singapore: Springer, 2017: 49-73.

[12] 蔣琪琪, 許建建, 蘇越, 張琦, 曹鵬, 宋晨虎, 李中安, 宋震. 柑橘黃化花葉病毒侵染性克隆構建及應用. 中國農業科學, 2022, 55(24): 4840-4850.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2022. 24.005.

Jiang Q Q, Xu J J, Su Y, Zhang Q, Cao P, Song C H, Li Z A, Song Z. Construction and application of infectious clone of citrus yellow mosaic virus. Scientia Agricultura Sinica, 2022, 55(24): 4840-4850. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2022.24.005. (in Chinese)

[13] Gaddam S A, Kotakad V S, Reddy M N, SAIGOPAL D. Survey and indexing of citrus yellow mosaic virus infecting citrus species in rayalaseema region of Andhra Pradesh. Archives of Applied Science Research, 2012, 4(4): 1821-1824.

[14] Motghare M, Dhar A K, Kokane A, Warghane A, Kokane S, Sharma A K, Reddy M K, Ghosh D K.Quantitative distribution of citrus yellow mosaic badnavirus in sweet orange () and its implication in developing disease diagnostics. Journal of Virological Methods, 2018, 259: 25-31.

[15] Singh R P, Dilworth A D, Baranwal V K, GUPTA K N. Detection of citrus exocortis viroid, iresine viroid, and tomato chlorotic dwarf viroid in new ornamental host plants in India. Plant Disease, 2006, 90(11): 1457.

[16] Borah B K, JOHNSON A M, GOPAL D V R, DASGUPTA I. A comparison of four DNA extraction methods for the detection of citrus yellow mosaic badna virus from two species ofusing PCR and dot-blot hybridization. Journal of Virological Methods, 2008, 151(2): 321-324.

[17] Baranwal V K, Majumder S, Ahlawat Y S, SINGH R P. Sodium sulphite yields improved DNA of higher stability for PCR detection of citrus yellow mosaic virus from citrus leaves. Journal of Virological Methods, 2003, 112(1/2): 153-156.

[18] Gopi V, Sankar T, Kuruba G, Lakshmi M. Molecular detection of citrus yellow mosaic virus (CYMV) and citrus greening bacterium (CGB) in Sathgudi sweet orange by duplex polymerase chain reaction (dPCR). International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 2016, 5(12): 726-732.

[19] Gopi V, Gopal K, Sankar T G, Palanivel S. Detection of citrus yellow mosaic virus by PCR and nucleic acid spot hybridisation using non-radioactive probes in commercial citrus species. Archives of Phytopathology and Plant Protection, 2010, 43(9): 892-899.

[20] Kumar P V, Sharma S K, Rishi N, GHOSH D K, BARANWAL V K. An isothermal based recombinase polymerase amplification assay for rapid, sensitive and robust indexing of citrus yellow mosaic virus. Acta virologica, 2018, 62(1): 104-108.

[21] JOHNSON A M, Dasgupta I, GOPAL D V R. Development of loop-mediated isothermal amplification and SYBR green real-time PCR methods for the detection ofcitrus yellow mosaic badnavirus in citrus species. Journal of Virological Methods, 2014, 203: 9-14.

[22] Ghosh D K, Aglave B, Baranwal V K. Simultaneous detection of one RNA and one DNA virus from naturally infected citrus plants using duplex PCR technique. Current Science, 2008, 94(10): 1314-1318.

[23] JOHNSON A M. Genomics development of diagnostics of citrus yellow mosaic badnavirus (CMBV) infecting citrus species and partial characterization of zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) isolates infecting Cucurbits in Andhra Pradesh[D]. India: Sri Venkateswara University, 2011.

[24] 王艷嬌, 崔甜甜, 黃愛軍, 陳洪明, 李中安, 周常勇, 宋震. 柑橘脈突病毒實時熒光定量RT-PCR檢測體系的建立與應用. 園藝學報, 2016, 43(8): 1613-1620.

Wang Y J, Cui T T, Huang A J, Chen H M, Li Z A, Zhou C Y, Song Z. Development and application of a quantitative RT-PCR approach for quantification of citrus vein enation virus. Acta Horticulturae Sinica, 2016, 43(8): 1613-1620. (in Chinese)

[25] 李楠, 王亞迪, 楊軍玉, 丁麗, 王亞南, 曹克強. 蘋果褪綠葉斑病毒在蘋果植株體內的分布. 北方園藝, 2018(13): 47-52.

Li N, Wang Y D, Yang J Y, Ding L, Wang Y N, Cao K Q. Spatial and temporal distribution of apple chlorotic leaf spot virus in apple plant. Northern Horticulture, 2018(13): 47-52. (in Chinese)

[26] 劉科宏, 周常勇, 宋震, 周彥, 李中安, 唐科志. 運用實時熒光RT-PCR技術檢測柑橘碎葉病毒. 果樹學報, 2009, 26(5): 748-751.

Liu K H, Zhou C Y, Song Z, Zhou Y, Li Z A, Tang K Z. Detection of citrus tatter leaf virus (CTLV) by real-time RT-PCR. Journal of Fruit Science, 2009, 26(5): 748-751. (in Chinese)

[27] 王瑩. 高溫抑制檸檬黃脈病癥狀表現的機理初探[D]. 重慶: 西南大學, 2022.

Wang Y. Preliminary study on the mechanism of high temperature inhibiting the symptoms of lemon yellow vein clearing disease[D]. Chongqing: Southwest University, 2022. (in Chinese)

[28] Zhang X, Zhang X, Singh J, Li D W, Qu F. Temperature- dependent survival of turnip crinkle virus-infectedplants relies on an RNA silencing-based defense that requires dcl2, AGO2, and HEN1. Journal of virology, 2012, 86(12): 6847-6854.

[29] Ding X S, Flasinski S, Nelson R S. Infection of barley by brome mosaic virus is restricted predominantly to cells in and associated with veins through a temperature-dependent mechanism. Molecular Plant-Microbe Interactions, 1999, 12(7): 615-623.

[30] 陶寧穎. ‘陽光玫瑰’葡萄病毒病原鑒定與脫毒技術研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2019.

Tao N Y. The research of the virus identification and elimination techniques on ‘Shine Muscat’ grape[d]. Hangzhou: Zhejiang University, 2019. (in Chinese)

[31] 徐振鵬, 邱隆, 楊婷, 林宏輝, 席德慧. 高溫對本氏煙抗病毒機制影響的研究. 四川大學學報(自然科學版), 2019, 56(4): 749-757.

Xu Z P, Qiu L, Yang T, Lin H H, Xi D H. The research on the interaction between high temperature and viral defense mechanism in. Journal of Sichuan University (Natural Science Edition), 2019, 56(4): 749-757. (in Chinese)

[32] 弟豆豆. 蘋果壞死花葉病毒煙臺分離物的鑒定與表達特性分析[D].煙臺: 煙臺大學, 2020.

Di D D. Identification and analysis of expression characteristics of apple necrosis mosaic virus Yantai isolate[D]. Yantai: Yantai University, 2020. (in Chinese)

Real-time quantitative PCR detection of citrus yellow mosaic virus and its spatial and temporal distribution in host plants

Cao Peng, Xu Jianjian, Li Chuxin, WangXinliang, Wang ChunQing, Song ChenHu, Song Zhen

Citrus Research Institute, Southwest University/National Citrus Engineering Research Center, Chongqing 400712

【Background】Citrus yellow mosaic virus (CYMV) is a member of badnaviruses that was first discovered in India and caused serious damage to its citrus industry. At present, CYMV has been listed as a quarantine pest in the United States, Japan, New Zealand, Europe and the Mediterranean region, which has the potential risk of being introduced into China.【Objective】The objective of this study is to establish a real-time quantitative PCR (qPCR) detection system for CYMV, screen sensitive citrus varieties to CYMV, elucidate the spatial and temporal distribution of CYMV in host plant, and to provide technical support for monitoring of the virus.【Method】According to the conserved sequences of CYMV coat protein (CP) gene in NCBI, eight pairs of qPCR primers were designed using software Primer Premier 5, and were screened by conventional PCR for primer pairs with good amplification effect and high specificity. The concentration and annealing temperature of the primers were optimized to establish the CYMV qPCR detection system. The specificity of the system was evaluated by detecting different citrus pathogens. Conventional PCR and qPCR were performed in parallel with 1.98×109-1.98 copies/μL of plasmid standards diluted in a gradient as template to evaluate the sensitivity of the established system. The field citrus samples were collected randomly and detected using conventional PCR and qPCR in parallel to evaluate the applicability of the method. Fifteen citrus varieties including Yuhuanyou (), Chandler pomelo (), No.22 karatachi (), etc., were inoculated with CYMV for symptom observation and molecular detection to screen sensitive indicator plants. Samples from different tissues of Madam Vinous orange () plants were collected at different times post inoculation, and qPCR assays were performed withelongation factor 1 alpha as an internal reference gene to clarify the spatial and temporal distribution patterns of CYMV in the host plants.【Result】The qPCR detection system for CYMV was established with the optimal primer of CYMV-qF7/R7, the optimal concentration 200 nmol·L-1and the optimal annealing temperature 63 ℃. The results of the evaluation experiments showed that the specificity of the established qPCR system is strong, and the detection sensitivity is 1 000 times that of the conventional PCR. The detection results of 660 field citrus samples from different regions showed that the qPCR assay was consistent with the conventional PCR assay, and no CYMV-positive plants were detected except for the positive control. Among the 15 citrus varieties in the inoculation experiment, Yuhuanyou and Chandler pomelo showed strong and typical yellowing mosaic symptoms of CYMV infection at the earliest, suggesting that both could be used as sensitive indicator plants. The detection results of qPCR showed that the titer of CYMV in old leaves was the highest, the titer of virus in old cortex and root was higher, and the titer in tender cortex was lower. The relative content of CYMV in plants was highest from July to September, then decreased month by month, and reached the lowest value in January of the next year. From February of the next year, the relative content of CYMV began to rise, which was consistent with the change trend of the environmental temperature.【Conclusion】A qPCR assay for CYMV detection with high specificity and sensitivity was established, and the spatial and temporal distribution pattern of CYMV in the host plants was determined. In addition, Yuhuanyou and Chandler pomelo can be used as CYMV-sensitive indicator plants.

citrus yellow mosaic virus (CYMV); real-time quantitative PCR (qPCR); spatial and temporal distribution

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.18.007

2023-06-14；

2023-07-19

國家重點研發計劃（2021YFD1400800）、重慶市自然科學基金（CSTB2022NSCQ-MSX0752）

曹鵬，E-mail：caopeng540@163.com。許建建，E-mail：swuxujj@foxmail.com。曹鵬和許建建為同等貢獻作者。通信作者宋震，E-mail：songzhen@cric.cn

（責任編輯 岳梅）