甲醛和β-丙內(nèi)酯對禽流感病毒血凝抑制抗原滅活效果的比較

張娜，劉興剛，牛亞麗，王亞楠，姜東，李娥，余海濤

（豪威生物科技有限公司，天津 武清 301700）

1992 年，H9N2 禽流感病毒（AIV）在廣東地區(qū)首次發(fā)生，隨后向其他地區(qū)蔓延[1]，1998 年，擴(kuò)散到部分省份[2]，已成為雞群中流行的禽流感病毒的主要亞型[3]。禽流感的防治目前主要采用的是滅活疫苗進(jìn)行免疫接種，滅活疫苗效力檢驗一般采用抗體檢測的方法。禽流感抗體檢測通常采用血凝抑制方法（HI）、瓊脂擴(kuò)散檢驗法（AGP）和ELISA 方法，其中HI 以其簡便、快捷、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點成為最常用的檢測方法。

為保證檢測環(huán)境不被污染，HI 檢測所需要的禽流感抗原需要經(jīng)過滅活處理。甲醛作為最常用的一種滅活劑，廣泛用于滅活疫苗的生產(chǎn)中[4]。甲醛滅活作用于病毒核酸的同時也作用于殼蛋白，可能破壞病原體蛋白的抗原性。據(jù)文獻(xiàn)報道，β-丙內(nèi)酯具有對H9N2 滅活能力強(qiáng)、對HA 效價影響小且在機(jī)體內(nèi)極易水解成無殘留、無害產(chǎn)物等優(yōu)點[5]。因此，本文通過將H9N2 病毒接種SPF雞胚，收獲尿囊液，分別用甲醛和β-丙內(nèi)酯進(jìn)行滅活、凍干，并在不同溫度條件下進(jìn)行保存，定期進(jìn)行病毒HA 效價檢驗。結(jié)果表明，與甲醛滅活效果比較，采用β-丙內(nèi)酯滅活的方法對病毒HA 效價影響更小，穩(wěn)定性也更好。

1 材料

1.1 毒種

禽流感病毒（WD 株）毒種（效價107.63EID50/0.1 mL），由豪威生物科技有限公司提供。

1.2 SPF 雞胚

購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.3 檢驗用試劑和試劑盒

禽流感病毒（AIV）H9 亞型HI 試驗用陽性血清購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，陰性血清購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司；雞減蛋綜合征陽性血清及雞新城疫紅細(xì)胞凝集抑制試驗（HI）用陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.4 無菌檢驗用培養(yǎng)基

購自北京中海生物科技有限公司 。

1.5 主要儀器

生物安全柜（型號BSC-1100-L ⅡB2）購自北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；移液器購自Sartorius、eppendorf、RAININ；孵化器（FQ-1）購自黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；管式離心機(jī)（型號GQLY-125N）購自遼寧富一機(jī)械有限公司；醫(yī)用離心機(jī)[TD3(800B)] 購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，膜包（100 k）購自密理博公司；真空冷凍干燥機(jī)（GZLY-0.2）購自奧特佳美科技（北京）有限公司； 高壓蒸汽滅菌器 （型號為MOST-L 型） 購自山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9272B） 購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

2 試驗方法

2.1 抗原制備

禽流感毒種稀釋5 000 倍，接種10 日齡SPF雞胚300 枚，培養(yǎng)至72 h，棄掉48 h 前非特異性死亡雞胚，至4 ℃放置12~24 h，無菌收獲尿囊液（每胚預(yù)計收獲10 mL），混勻后測定血凝價，HA 應(yīng)≥1:29。

2.2 抗原澄清濃縮

先將收獲的禽流感病毒液分別經(jīng)管式離心機(jī)按照 10 000 r/min 轉(zhuǎn)速，離心澄清。再利用蠕動泵提供動力，采用100 k 膜堆對澄清后的禽流感病毒液進(jìn)行濃縮。病毒液在經(jīng)過膜包時小分子物質(zhì)經(jīng)膜包的內(nèi)壁滲透出來成為濾出液，而病毒液中的病毒蛋白等大分子物質(zhì)則得以保留并返回至濃縮罐中。依此往復(fù)循環(huán)將禽流感病毒液濃縮至原體積的 1/4 終止，收集濃縮后病毒液并測定血凝價。

2.3 滅活

2.3.1 甲醛滅活 取濃縮后的一半抗原，按原量的1%加入4 倍稀釋后的甲醛，37 ℃滅活24 h，中間搖3~4 次，收至2~8 ℃保存，按現(xiàn)行版《中華人民共和國獸藥典》做無菌檢驗及滅活檢驗，并測定血凝價[6]。

2.3.2 β 丙內(nèi)酯滅活 取剩余的一半抗原，按抗原量的1/4000 加入β-丙內(nèi)酯，2~8 ℃滅活24 h，中間搖3~4 次。

2.4 抗原檢驗

滅活后的抗原做無菌及滅活檢驗，測定血凝價，HA 應(yīng)≥1:29。

2.5 保護(hù)劑配制及凍干

凍干保護(hù)劑配制：按照最后的配苗總量測算，凍干總量中含明膠0.8%、蛋白胨1%、蔗糖3% ，高壓條件116 ℃ 40 min，將配好的保護(hù)劑與滅活抗原按2:3 比例混勻分裝至西林瓶中，每瓶2 mL，凍干，冷凍保存，備用。

2.6 檢驗

2.6.1 真空度測定 按現(xiàn)行版《中華人民共和國獸藥典》檢驗[6]，應(yīng)出現(xiàn)輝光。

2.6.2 物理性狀 眼觀凍干抗原物理性狀是否為白色海綿狀疏松團(tuán)塊，是否易與瓶壁脫離，加稀釋液后是否迅速溶解。

2.6.3 無菌檢驗 按現(xiàn)行版《中華人民共和國獸藥典》檢驗[6]，應(yīng)無菌生長。

2.6.4 特異性檢驗 將制備的抗原分別對雞新城疫陽性血清、禽流感（H9 亞型）陽性血清、雞減蛋綜合征陽性血清進(jìn)行HI 試驗[6]，鑒定其對本病毒產(chǎn)生的抗體反應(yīng)的特異性。

2.6.5 穩(wěn)定性檢驗[7]將凍干好的抗原，分別在4、-20℃條件下保存，并于1 d 和1 、3、6 、9 、12 、15、18 、21 、24 個月各拿出1 支，進(jìn)行HA測定，每個時間段均要進(jìn)行2 次重復(fù)測定，評價不同保存溫度及時間對不同滅活劑滅活的禽流感抗原血凝效價的影響。

3 結(jié)果

3.1 抗原制備結(jié)果

禽流感（WD 株）毒種接種SPF 雞胚300 枚，培養(yǎng)后收獲雞胚液約3 300 mL，測定血凝價，離心濃縮至約800 mL，再測定血凝價，400 mL 經(jīng)甲醛滅活，400 mL 經(jīng)β-丙內(nèi)酯滅活，測定血凝價，無菌檢驗及滅活檢驗結(jié)果均合格，如表1 所示。甲醛滅活后，HA 可達(dá)10log2；β-丙內(nèi)酯滅活，HA 可達(dá)11log2。

表1 禽流感（WD）株抗原制備檢驗結(jié)果

3.2 分裝凍干

將配制好的保護(hù)劑分別與兩種滅活抗原按2:3比例混勻，分裝至西林瓶中，每瓶2 mL，凍干。

3.3 抗原檢驗

3.3.1 真空度測定 兩種抗原各取40 瓶進(jìn)行真空度測定，全部出現(xiàn)紫色輝光，表明結(jié)果合乎規(guī)定。

3.3.2 物理性狀 眼觀凍干抗原，物理性狀為白色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解，結(jié)果顯示符合規(guī)定。

3.3.3 無菌檢驗 按現(xiàn)行獸藥典進(jìn)行抽樣檢驗，各組檢驗10 瓶，結(jié)果顯示均無菌生長。

3.3.4 特異性檢驗 將制備的抗原分別對雞新城疫陽性血清、禽流感（H9 亞型）陽性血清、雞減蛋綜合征陽性血清進(jìn)行HI 試驗，結(jié)果表明各毒株對本病毒產(chǎn)生的抗體反應(yīng)均有特異性，禽流感（H9亞型）陽性血清效價為1:29，ND、EDS 均為陰性。

3.3.5 穩(wěn)定性檢驗 不同保存溫度對不同滅活劑抗原血凝效價的影響（表2），每次用新開封抗原，減少反復(fù)凍融對其影響。

表2 溫度和時間對甲醛和β- 丙內(nèi)酯滅活抗原血凝效價的影響

通過表2 可知，甲醛滅活凍干后的抗原-20℃保存至3 個月HA 開始下降，2~8℃保存至6 個月HA開始下降；β-丙內(nèi)酯滅活凍干后的抗原2~8 ℃及-20℃放置18 個月效價均無變化，到21 個月效價略有下降，說明β-丙內(nèi)酯滅活的H9 亞型禽流感抗原保存時間長，穩(wěn)定性好。

4 討論

HI 試驗可以用于以下幾方面： 第一，檢測血清中的抗體水平； 第二，鑒定病毒的類型及亞型；第三，輔助診斷病毒性疾病； 第四，作為適時實施免疫的依據(jù)，從而避免免疫空檔期及重復(fù)免疫造成的損失。抗原質(zhì)量的差異對禽流感 HI 試驗結(jié)果準(zhǔn)確性起到了決定性作用。

目前國內(nèi)許多禽病滅活疫苗都用甲醛作滅活劑。對滅活疫苗的生產(chǎn)起到一定的作用，血凝抑制用抗原制備往往也用甲醛進(jìn)行滅活。甲醛既可作用于病毒核苷酸堿基（如A、G、U），又可作用病毒殼蛋白。作用于病毒殼蛋白時，易使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)或病毒顆粒聚集，故不能再作用于殼蛋白內(nèi)的核酸。這樣，病原體蛋白的抗原性會遭到嚴(yán)重破壞，并可能有病原體存活的概率；用甲醛滅活時間長，一般需要在37~39 ℃處理24 h 以上或更長時間。在本抗原的研制過程中，前期使用甲醛進(jìn)行滅活，驗證顯示，甲醛滅活后抗原效價受影響大，且不穩(wěn)定，保存期短，給生產(chǎn)中帶來一定困擾。β-丙內(nèi)酯是一種有機(jī)化合物，用作殺菌消毒劑具有對H9N2 滅活能力強(qiáng)、HA 效價影響小的特點[5]。β-丙內(nèi)酯易水解，無殘留，水解后無危害；可直接作用于病毒或病原核酸，改變病毒核酸結(jié)構(gòu)達(dá)到滅活目的，不直接作用于蛋白，且滅活效果理想，滅活時間短，能縮短疫苗生產(chǎn)周期。因此，自1984 年β-丙內(nèi)酯作為狂犬疫苗滅活劑使用以來，已成功并廣泛地應(yīng)用于多種人和動物疫苗的生產(chǎn)。

本試驗共制備出了符合要求的H9 抗原190瓶；通過對比甲醛滅活和β-丙內(nèi)酯滅活禽流感抗原的效價，結(jié)果顯示甲醛滅活的抗原凍干后效價下降，2~8 ℃可以保存6 個月，-20 ℃僅可保存3 個月；β-丙內(nèi)酯滅活的抗原凍干后HA 保持不變，在2~8 ℃及-20 ℃均可以保存18 個月，效價無變化，具有保存時間長、穩(wěn)定性好的優(yōu)點可用于實驗血清抗體檢測。本研究建立了血凝抑制抗原制備方法，為相關(guān)抗體檢測和不同毒株的交叉保護(hù)試驗奠定了基礎(chǔ)。