當(dāng)前我國(guó)雞群傳染性法氏囊病感染情況調(diào)查

蒲興，黨海斌，陳露

[1.南昌勃林格殷格翰動(dòng)物保健有限公司，江西 南昌 330096；2.勃林格殷格翰動(dòng)物保健（中國(guó)）有限公司上海分公司，上海 200040]

傳染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是一種主要危害雛雞的烈性、高度接觸性傳染病，主要侵害雞的淋巴組織法氏囊，雛雞早期感染本病后會(huì)造成嚴(yán)重的免疫抑制，該病目前呈世界性分布，其田間毒株流行情況也在不斷變化。引起該病的傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus, IBDV）為無(wú)囊膜的雙股RNA病毒，基因組由A、B 兩個(gè)片段組成，其中B 片段負(fù)責(zé)編碼法氏囊病毒五種主要蛋白中的VP1 蛋白，而A 片段負(fù)責(zé)編碼VP2、VP3、VP4 及VP5蛋白，VP2 蛋白負(fù)責(zé)誘導(dǎo)雞產(chǎn)生中和性保護(hù)抗體。法氏囊病毒目前分為兩個(gè)血清型，血清Ⅰ型對(duì)雞致病，而血清Ⅱ型對(duì)雞不致病。IBDV 非常穩(wěn)定，對(duì)大多數(shù)消毒劑例如乙醚、氯仿不敏感，在pH 12條件下病毒失活，但在pH 2 時(shí)病毒不受影響，在污染的飼料、水及糞便中可以長(zhǎng)期存活。IBDV 難以滅活的特性是它能夠在雞群長(zhǎng)期存在的主要原因，甚至經(jīng)過(guò)消毒及清洗的雞舍也是如此。目前防控IBD 主要靠疫苗免疫，同時(shí)輔以良好的生物安全措施。為了解目前國(guó)內(nèi)IBD 的最新流行情況，近期采集了IBD 高發(fā)的3~5 周齡雞群的法氏囊組織進(jìn)行PCR 病原學(xué)監(jiān)測(cè)。

1 材料和方法

1.1 臨床樣品采集和處理

從2020 年8 月至2023 年5 月，采集了我國(guó)主要家禽養(yǎng)殖區(qū)域的白羽肉雞、蛋雞及黃羽肉雞共計(jì)90 個(gè)雞群的480 份法氏囊組織樣品（表1），使用PBS（pH 7.2）制備10%組織勻漿（重量體積比），3 000 g、4 ℃離心10 min 取上清待檢。

表1 不同類(lèi)型雞群IBD 樣品數(shù)量

1.2 病毒RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和測(cè)序

從組織勻漿上清中，使用磁珠法提取病毒總RNA。 采用一步法RT-PCR（Invitrogen,Cat#12574026），PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為1 350 bp，覆蓋IBDV VP2 基因。

上游引物序列：5′-ATGGCGAACCTGCAAG ATCA-3′；下游引物序列：5′-TGGCCCGGATTATG TCTTTGA-3′。

一步法RT-PCR 反應(yīng)條件：cDNA 合成和預(yù)變性1 個(gè)循環(huán)：54 ℃ cDNA 合成30 min，94 ℃預(yù)變性2 min；PCR 反應(yīng)35 個(gè)循環(huán)：94 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸120 s；68 ℃最終延伸10 min 后4 ℃保持或進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，陽(yáng)性PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Sanger 測(cè)序。

1.3 VP2 基因序列與進(jìn)化樹(shù)分析

分析成功雙向測(cè)通樣品，使用Geneious prime軟件中Geneious Alignment 和Neighbor-joining 默認(rèn)參數(shù)分析和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 不同類(lèi)型雞群的IBDV 病原陽(yáng)性檢出率

按照白羽肉雞、蛋雞及黃羽肉雞等雞群類(lèi)型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中白羽肉雞及蛋雞的法氏囊樣品全部來(lái)自商品代雞群；黃羽肉雞既有來(lái)自商品代雞群的樣品，也包含父母代雞群的法氏囊樣品，檢測(cè)結(jié)果如表2 所示。不同類(lèi)型雞群都有IBDV 野毒檢出，陽(yáng)性率為17.33%~41.46%。其中新型變異株在蛋雞中檢出陽(yáng)性率最高，為39.02%。

表2 不同類(lèi)型雞群IBD 野毒陽(yáng)性檢出率

2.2 不同省份IBDV 病原陽(yáng)性檢出率

不同省份IBD 野毒陽(yáng)性檢出率見(jiàn)表3。結(jié)果顯示8 個(gè)采樣的省份檢出野毒感染，集中在遼寧、河北、廣西、山東等養(yǎng)殖省份，超強(qiáng)毒株的陽(yáng)性率從1.99%至12%不等；而新型變異株仍然是主要的毒株類(lèi)型，陽(yáng)性率從18.67%至33.77%不等。。

表3 不同省份IBD 野毒陽(yáng)性檢出率

2.3 不同免疫程序IBDV 病原陽(yáng)性檢出率

按照不同的IBD 免疫程序?qū)Y(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，如表4 所示。不同的免疫程序都有野毒感染檢出情況，新型變異株IBDV 是感染率最高的毒株類(lèi)型。具體來(lái)看：只使用IBD 滅活疫苗的雞群存在變異株感染的比例為28.75%，只使用載體疫苗的雞群變異株感染的比例為25%，同時(shí)使用載體疫苗和活苗的雞群未檢測(cè)到變異株感染情況，而單獨(dú)使用活疫苗的雞群感染比例高達(dá)83.33%。

表4 不同免疫程序IBD 野毒陽(yáng)性檢出率

基于VP2核酸序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)關(guān)系見(jiàn)圖1。監(jiān)測(cè)結(jié)果反映，單獨(dú)免疫任何一種類(lèi)型的疫苗，都不能完全阻止IBDV 野毒特別是新型變異株的感染。載體疫苗加上活疫苗的免疫雞群未檢測(cè)到野毒感染，可能是樣品數(shù)量較少的緣故。

圖1 IBDV VP2核苷酸氫列進(jìn)化樹(shù)分析（詳見(jiàn)附錄彩圖）

2.4 序列分析

63 株雙向測(cè)通的IBDV 新型變異株序列分析顯示其與超強(qiáng)株、經(jīng)典株、減毒株、變異株的核苷酸一致性分別為91.76%~93.56%、93.48%~94.05%、92.90%~93.72%和93.97%~95.68%。雖然新型變異株與美國(guó)變異株E、E/Del 屬同一進(jìn)化樹(shù)分支，但明顯區(qū)分為2 個(gè)亞支。新型變異株可分為2 個(gè)組，新型變異株組1 和新型變異株組2，二者的核苷酸一致性為95.84%~99.9%。成功分型的變異株中，79.7%（59/74）為新型變異株組1，樣品分別來(lái)自遼寧省、山東省、河北省和江蘇省；新型變異株組2 樣品來(lái)自遼寧省和河北省。

新型變異株的氨基酸序列與美國(guó)變異株參考毒株一致性為96.81%~98.24%，與其他參考毒株的氨基酸一致性為93.63%~96.81%，與美國(guó)變異株有共同的特征性氨基酸位點(diǎn)為213N、222T、249K、279N、318D 和323E。新型變異株特有的氨基酸位點(diǎn)為77D、221K、252I 和254N。除了上述共有的特征性位點(diǎn)，新型變異株的2 個(gè)組系也擁有獨(dú)特的特征性位點(diǎn)，新型變異株組1 特有氨基酸位點(diǎn)為359K，新型變異株組2 特有氨基酸位點(diǎn)為73I、79S 和187V。

3 討論

2017 年以后（包括2017 年）已報(bào)道的關(guān)于IBDV 流行趨勢(shì)的文章數(shù)量不多，王秀云指出IBDV 變異株在華東六省流行比較普遍[1]；廣西大學(xué)韋平老師實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的IBDV 在廣西流行趨勢(shì)的文章指出超強(qiáng)株在廣西仍然是主要流行毒株[2]，這與我們本次調(diào)研的結(jié)果一致。本次監(jiān)測(cè)多數(shù)樣品來(lái)源于臨床無(wú)明顯IBD 發(fā)病癥狀的健康雞群，少數(shù)來(lái)源于IBD 發(fā)病雞群，說(shuō)明目前由強(qiáng)毒造成的典型法氏囊疾病在雞群依然存在，而新型變異株的隱性感染更加普遍，新型變異株IBDV 感染的雞群往往觀察不到明顯的臨床癥狀，且對(duì)生產(chǎn)成績(jī)可能沒(méi)有明顯的影響，當(dāng)然這也受到不同地區(qū)疾病壓力、雞舍環(huán)境條件等因素的綜合影響，還需要田間大數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證。本次調(diào)查中分離到的新型變異株可以分為兩個(gè)類(lèi)群，親緣關(guān)系較近，VP2 核苷酸一致性為95.84%~99.9%，而它們與經(jīng)典毒株、超強(qiáng)毒株及美國(guó)變異株等其他類(lèi)型毒株有一定遺傳距離。

IBDV 變異株可能早已經(jīng)存在自然界中，但是直到20 世紀(jì)80 年代中期才初次在美國(guó)被報(bào)道，2019 年以來(lái)我國(guó)陸續(xù)報(bào)道了雞傳染性法氏囊病毒新型變異株致病的病例[3]。變異株可能的來(lái)源之一是免疫壓力下病毒發(fā)生突變，另外的一種可能就是不同毒株之間的重組，例如不同活疫苗毒株使用后在田間發(fā)生的自然重組。伴隨著IBDV 毒株的不斷演變，防控該病的疫苗也在不斷的更新迭代，出現(xiàn)了從第一代的傳統(tǒng)減毒活疫苗和滅活疫苗到第二代的抗原抗體復(fù)合物疫苗，再到第三代的以火雞皰疹病毒（HVT）為載體插入法氏囊病毒VP2 片段的載體疫苗。IBD 疫苗選擇的基本原則：首先是安全性，不應(yīng)該對(duì)免疫雞只的法氏囊造成損傷從而引起免疫抑制；其次是可以有效控制該病，并且免疫保護(hù)期長(zhǎng)；再次是盡量避免向環(huán)境排毒造成環(huán)境污染；最后就是免疫操作的時(shí)機(jī)及便捷性[4]。雞舍環(huán)境相對(duì)孵化場(chǎng)來(lái)講更加復(fù)雜，在田間免疫IBD 活疫苗經(jīng)常發(fā)生一免疫雞群就發(fā)病的現(xiàn)象，屬于典型的免疫應(yīng)激，因此在孵化場(chǎng)免疫IBD 疫苗是防控該病的首選。據(jù)研究，IBDV 變異株具有較強(qiáng)的突破雛雞母源抗體的能力，因此可以在一周之內(nèi)就感染雛雞，這將造成嚴(yán)重的免疫抑制，也是目前需要重點(diǎn)關(guān)注的變異株感染雞群帶來(lái)的不利影響[5-6]。當(dāng)前利用變異株制作亞單位油苗在實(shí)驗(yàn)室條件下取得不錯(cuò)的免疫保護(hù)效果，具體使用效果及可防控的田間野毒范圍仍然還需要田間大數(shù)據(jù)的驗(yàn)證[7]。結(jié)合以往國(guó)內(nèi)外的報(bào)道及我們的監(jiān)測(cè)結(jié)果來(lái)看，目前國(guó)內(nèi)雞群IBDV 超強(qiáng)毒株感染依然存在，而新型變異株已經(jīng)成為當(dāng)前感染雞群的主要毒株。