高效液相法測定海洋硅藻中5種葉黃素類化合物*

汪麗婷，朱軍旺，肖 玉，周成旭，張金榮

(寧波大學 食品與藥學學院，浙江 寧波 315832)

海洋硅藻是一類重要的海洋生物，其作為海洋生態環境最主要的初級生產者，參與到海洋生態系統的物質和能量循環，對維持海洋生態系統具有重要的作用[1-2]。海洋硅藻具有多種功能，已經廣泛應用于現代農業、工業廢水綜合利用以及高價值商業產品可持續生產[3-4]。它具有光合效率高、可規模化培養、并且培養不受季節影響、不占用耕地的優勢[5-6]。特別值得關注的是，海洋硅藻富含多種有益健康的活性成分，包括葉黃素類、多糖、蛋白質、不飽和脂肪酸等，具有巨大開發潛力，已經廣泛應用于醫藥、食品、水產養殖等多個領域[7-8]。而且，它能產生特定的高價值化合物[9-10]。因此，近幾十年來，硅藻的種質創新、培養模式和條件的優化，及硅藻中高值化成分的生物精煉均已獲得了極大的關注[11-14]。

海洋硅藻中含有多種葉黃素類成分，包括新黃素、玉米黃素、巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素等[15-16]，其中，巖藻黃素是自然界中最豐富的葉黃素類成分，約占所有類胡蘿卜總產量的10%[17]，硅甲藻黃素、硅藻黃素是海洋硅藻的特征色素[18]，新黃素和玉米黃素廣泛存在于海洋浮游藻類中[19]，這5種葉黃素類成分均具有多種生物活性[20-23]。

高效液相色譜法具有分析速度快、靈敏度高、重復性高、適用范圍廣等優點，已經廣泛應用于合成化學、生命科學、環境監測、食品檢驗等領域[24-25]。為了評估海洋環境中浮游藻類組成和物種多樣性，Jayaraman等采用高效液相色譜法可一次運行達到有效分析60多種成分，實現了多組分的同時定量測定[26]，但該測定方法需要過多的標準品。為了明確銅藻的漂浮生長機制，張恒等采用液質聯用分析技術比較分析了不同來源銅藻中10種色素種類及分布規律[27]。為了比較不同海洋微藻之間色素組成及分布情況，鄭立洋等采用液質聯用分析技術測定了海洋微藻中葉綠素a、葉綠素b、β，β-胡蘿卜素、葉黃素和巖藻黃素的含量[28]。然而，液質聯用分析技術需要使用的設備昂貴、分析成本高、操作復雜[29]。因此，針對海洋硅藻中葉黃素類成分，需要建立一種簡便、專屬性強、靈敏度高的分析方法，為硅藻高值化利用的藻種篩選和生物精煉提供條件。現已發展多種用于HPLC分離的色譜柱，其中，反相色譜柱是以鍵合非極性基團的載體為填充劑的色譜柱，最常用的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)，C18有較高的碳含量和較好的疏水性，適用于大多數化合物的分析，具有分離度高、重現性好、使用壽命長等優點，已在各國藥典中廣泛應用于大多數藥品的分析測定[30-31]。為實現硅藻中葉黃素類組分高值化利用過程的表征及藻種的定性篩選，本文采用C18色譜柱作為固定相，建立了不同海洋硅藻中5種葉黃素類化合物(包括新黃素、硅藻黃素、硅甲藻黃素、玉米黃素及巖藻黃素)的定量分析方法，并利用該方法比較了8種海洋硅藻之間5種葉黃素類化合物的分布情況。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters 2695高效液相色譜儀(配備PDA檢測器、柱溫箱、自動進樣器以及Empower數據處理系統)，美國Waters公司；Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美國Agilent公司；Scientz-10N普通型冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；GL-21M高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素、玉米黃素、新黃素5個標準品純度均高于95%，美國Sigma-Aldrich有限公司；0.22 μm 聚四氟乙烯(PTFE)濾膜針筒過濾器、乙腈(色譜級)均購置于上海安譜科技股份有限公司；丙酮，分析純，杭州高晶精細化工有限公司。

1.2 標準溶液的配制

新黃素、巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素和玉米黃素標準儲備液的配制：分別精確稱取新黃素、巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素和玉米黃素各 1.0 mg，分別置于 10 mL 棕色容量瓶中，用適量丙酮溶解、稀釋并定容至 10 mL，分別配制成5種標準儲備液，質量濃度均為 100 mg/L，標準儲備液用錫箔紙包裹置于 -20 ℃ 冰箱中避光保存。

新黃素、巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素和玉米黃素混合標準溶液的配制：準確吸取5種標準儲備液，配制得到質量濃度均為 20 mg/L 的5種混合標準溶液。

新黃素、巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素和玉米黃素混合標準系列工作液的配制：分別準確吸取適量混合標準溶液，用丙酮稀釋得到混合標準系列工作液，質量濃度分別為：0.1、0.2、0.5、0.75、1.0、2.0、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0 mg/L 。

1.3 藻株培養和生物質收集

表1所示的8株海洋硅藻均由寧波大學浙江省海洋生物重點實驗室微藻種質庫提供。用于海洋硅藻培養的海水均經脫脂棉過濾、煮沸消毒，所有容器均需高溫滅菌。本實驗選取的8株海洋硅藻均采用f/2培養基，在逐級擴大預培養基礎上，將生長至指數期的海洋硅藻接藻種在 5000 mL 錐形瓶中進行定量培養，水體總體積 3000 mL，各3組平行。在溫度為(23±1)℃、光照強度 50 μmol/(m2·s)，光照周期為L∶D=12 h∶12 h 的條件下培養 8 d，每天人工搖瓶2次。從接種硅藻第一天開始，每隔一日取樣用血球計數板檢測藻細胞數。8種硅藻均在平臺期收獲，藻液在 4 ℃，8000×g離心 20 min，棄去上清液，獲取硅藻細胞，將硅藻細胞冷凍干燥 48 h，獲得凍干藻粉。凍干藻粉用鋁箔包裹，于 -20 ℃ 冰箱中冷凍保存。凍干藻粉需在一個月內進行葉黃素類成分提取及分析。

表1 實驗用海洋硅藻藻株種名及庫存編號

1.4 海洋硅藻中葉黃素類成分的提取

海洋硅藻中葉黃素類成分的提取參照鄭立洋等[28]的方法，略加修改。海洋硅藻在指數生長期末尾收獲約 3000 mL 藻種培養液，準確稱量制備得到的硅藻凍干藻粉的質量，計算每 100 mL 海洋硅藻培養液應制得的凍干藻粉質量并準確稱取，放入 5 mL 具塞刻度試管中，加入 2.7 mL 冷丙酮，在冰水中超聲 2 min，再加入 0.3 mL 的去離子水，使丙酮最終含量為90%，將具塞刻度試管置于 -20 ℃ 冰箱中靜置過夜。海洋硅藻提取液在12000×g離心 10 min，取上清液經 0.22 μm 濾膜針式濾器過濾，取續濾液進行HPLC分析。為了避免提取過程中葉黃素類組分降解，以上實驗均在暗室的冰盒中進行，且處理得到的樣品應在 48 h 內進行HPLC分析。

1.5 HPLC色譜分析條件

采用高效液相色譜(HPLC)法對海洋硅藻提取物進行分離，用巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素、玉米黃素、新黃素等5個標準品作為參照物進行指標成分峰的定位。HPLC分析條件如下：使用安捷倫Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，粒徑 5 μm)，進樣量為 10 μL，柱溫為 25 ℃；流動相為乙腈(A)和純水(B)，流速為 2.0 mL/min，檢測波長為 450 nm。線性梯度洗脫程序見表2。

表2 流動相梯度洗脫程序

2 結果與討論

2.1 方法驗證

2.1.1 標準曲線、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

取新黃素、巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素和玉米黃素混合標準系列工作液，按照1.5節的HPLC色譜條件進行分析。由表3可知，新黃素、巖藻黃素和硅甲藻黃素的標準曲線范圍為0.2～20 mg/L；硅藻黃素的標準曲線范圍為2.0～20 mg/L；玉米黃素的標準曲線范圍為5.0～20 mg/L，5種葉黃素類成分在以上質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數r2均高于0.999。

表3 五種葉黃素類成分的標準曲線、線性范圍、檢出限和定量限

取混合標準溶液適量，采用逐級稀釋的方法進行稀釋并進行HPLC檢測，以信噪比(S/N)≥ 3為檢測限(LOD)。由表3可知，新黃素、巖藻黃素和硅甲藻黃素的檢測限均為 0.06 mg/L，硅藻黃素的檢測限為 0.66 mg/L，玉米黃素的檢測限為 1.00 mg/L；以信噪比(S/N)≥ 10為定量限(LOQ)，新黃素、巖藻黃素和硅甲藻黃素的定量限均為 0.20 mg/L，硅藻黃素的定量限為 2.00 mg/L，玉米黃素的定量限為 3.00 mg/L。

5個葉黃素類成分混合標準溶液(10 mg/L)的HPLC色譜圖見圖1。由圖1可知，新黃素、巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素和玉米黃素的保留時間分別為7.2、8.6、14.7、21.7、25.3 min，出峰時間合適，峰形良好，建立的方法對5種葉黃素類成分均具有良好的分離效果，表明該方法專屬性良好。

1.新黃素；2.巖藻黃素；3.硅甲藻黃素；4.硅藻黃素；5.玉米黃素。圖1 5種葉黃素類成分混合標準溶液(10 mg/L)的HPLC色譜圖

2.1.2 方法的精密度和回收率

選取低、中、高3個不同質量濃度的混合標準溶液進行HPLC測定，計算方法的日內精密度。每個樣品在一天內連續進樣5次，記錄5種葉黃素類成分的峰面積及保留時間，分別計算相應的峰面積和保留時間的日內精密度，測定結果見表4。由表4可知，5種葉黃素類成分峰面積的日內RSD為0.33%～3.56%，保留時間的日內RSD為0.13%～0.68%。

表4 五種葉黃素類成分的峰面積和保留時間的日內、日間測定精密度

選取低、中、高3個不同質量濃度的混合標準溶液進行HPLC測定，每天連續進樣測定5次，連續5天，記錄5種葉黃素類成分的峰面積及保留時間，分別計算相應的峰面積和保留時間的日間精密度，測定結果見表4。由結果可知，5種葉黃素類成分峰面積的日間RSD為1.07%～4.97%，保留時間的日間RSD為0.13%～1.15%。

經分析可知，新黃素、巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素和玉米黃素的峰面積和保留時間的日內、日間精密度RSD值均小于5%，說明本方法精密度良好。

準確稱取相同質量的梅尼小環藻(NMBguh026-8)樣品2份，其中1份加入已知量的含有5種葉黃素類成分的混標，另1份不加，2份樣品均采用1.4節所示方法提取樣品中葉黃素類化合物。兩份樣品均按照1.5節的HPLC色譜條件測定5次。根據加標樣品測出量減去未加標樣品測出量再除以標準加入量計算各組分的回收率，并根據5次平行測定的結果計算相對標準偏差，結果見表5。

表5 5種葉黃素類化合物的回收率

由表5可知，5種葉黃素類成分的回收率均在88.40%～115.00%，且RSD均低于5.0%。表明該方法能較好地滿足硅藻中葉黃素類化合物的分析要求。

2.2 樣品測定

海洋硅藻藻株收獲時，充分搖勻藻液，分別取1mL藻液，用血球計數板在顯微鏡下進行藻細胞計數。結果表明，三角褐指藻(NMBguh001)、角毛藻(NMBguh003-3)、角毛藻(NMBguh003-11)、角毛藻(NMBguh003-17)、中肋骨條藻(NMBguh004-2)、舟形藻(NMBguh006-6)、雙眉藻(NMBguh007)和梅尼小環藻(NMBguh026-8)的藻密度分別為5.85×105、4.50×105、4.65×105、6.00×105、8.03×105、3.00×105、2.33×105、1.05×105mL-1。按照1.4節建立的方法對每個藻株進行處理，每個樣品平行上機檢測3次，測定結果如表6所示。

表6 各種硅藻中5種葉黃素類成分含量

由表6可知，巖藻黃素和硅甲藻黃素存在于所有檢測的硅藻藻株中。其中，巖藻黃素含量在梅尼小環藻(NMBguh026-8)中最高(8.45×10-2ng/個)，在中肋骨條藻(NMBguh004-2)中最低(8.6×10-3ng/個)；硅甲藻黃素含量在雙眉藻中含量最高(3.82×10-2ng/個)，在中肋骨條藻(NMBguh004-2)中最低(7.00×10-4ng/個)。硅藻黃素存在于6種檢測的硅藻藻株，包括梅尼小環藻(NMBguh026-8)、角毛藻(NMBguh003-3)、角毛藻(NMBguh003-17)、角毛藻(NMBguh003-11)、舟形藻(NMBguh006-6)和雙眉藻(NMBguh007)。其中，硅藻黃素在梅尼小環藻(NMBguh026-8)中含量最高(4.56×10-2ng/個)，在角毛藻(NMBguh003-11)中含量最低(4.00×10-4ng/個)。新黃素和玉米黃素在所有檢測的硅藻藻株中均未檢測出來。

本方法可對海洋硅藻同時測定分析5種葉黃素類化合物，具有靈敏度高，效率高，操作方便的優點，為今后的硅藻中葉黃素類組分的分析提供了簡便的測定方法。

3 結論

本文建立了運用高效液相法同時測定海洋硅藻中5種葉黃素類化合物的方法，并進行了方法有效性驗證，包括方法的線性關系、相關系數、檢測限、定量限、日內精密度、日間精密度和回收率等。采用該方法測定分析了8種海洋硅藻中5種葉黃素類化合物的分布情況，發現巖藻黃素和硅甲藻黃素存在于所有檢測的硅藻藻株中，硅藻黃素存在于6種檢測的硅藻藻株中，新黃素和玉米黃素在所有檢測的硅藻藻株中均未檢測出來。該方法具有前處理過程簡單、分析靈敏高、重復性好的優點，有效避免了葉黃素類組分在長時間、復雜的前處理及分析檢測過程中的損失，提高了葉黃素類組分檢測的效率以及準確性。本方法可為硅藻中多種葉黃素類化合物的同時測定提供技術支持，為今后利用葉黃素類組分含量進行藻種優選、培養條件優化、制備技術開發提供了實驗分析手段。