老年膿毒癥相關性腦病患者血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT表達及對臨床預后評價

李雪蓮,冷凌涵,張麗涓,向相,宋家志,陳陶江,韓強,王平

膿毒癥相關性腦病(sepsis-associated encephalopathy,SAE)是繼發于中樞神經系統以外的感染引起的彌漫性腦功能損傷,病死率較高[1-2]。尋找能夠評估SAE預后的生物標志物具有重要臨床意義。外泌體是直徑為30～150 nm小囊泡,包含蛋白、脂質及RNA等[3]。長鏈非編碼RNA核富含豐富的轉錄本1(long noncoding RNA nuclear-enriched abundant transcript 1,lncNEAT1)能夠調節神經元棘突密度,參與SAE的疾病進展[4-5]。長鏈非編碼RNA SRY盒轉錄因子2重疊轉錄本(long noncoding RNA SOX2 overlapping transcript,LncSOX2OT) 是調節性別決定區Y框蛋白2(sex determining region Y-box2,SOX2)的非編碼RNA,可導致膿毒癥患者心肌細胞線粒體功能障礙的發生[6]。目前SAE患者血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT表達尚不清楚,本研究通過檢測SAE患者血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT的表達,分析兩者與生存預后的關系,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年2月—2022年2月就診于成都中醫藥大學附屬第五人民醫院重癥醫學科的老年SAE患者96例為SAE組,男51例,女45例,年齡 (71.95±6.04)歲;體質量指數(21.07±2.76)kg/m2;受教育年限(4.61±1.85)年;合并癥:高血壓史31例,糖尿病史17例;感染部位:肺部感染42例,尿路感染19例,血液感染22例,腹腔感染13例;根據SAE患者28 d內生存狀態將SAE組再分為生存亞組(n=50)和死亡亞組(n=46)。以同期診治的無SAE的膿毒癥患者60例為非SAE組,男33例,女27例,年齡(70.78±5.96)歲;體質量指數(21.18±2.72)kg/m2;受教育年限 (4.69±1.91)年;合并癥:高血壓20例,糖尿病10例;感染部位:肺部感染30例,尿路感染13例,血液感染10例,腹腔感染7例。SAE組和非SAE組患者性別、年齡、體質量指數、受教育年限、高血壓史、糖尿病史及感染部位比較差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會審核通過(2019SF-106),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①膿毒癥診斷符合膿毒癥3.0診斷標準[7];②SAE診斷排除藥物效應、電解質紊亂、代謝紊亂及腦膜炎、腦炎等原發性中樞神經系統病理狀態及非感染性全身炎性反應等引起的認知功能障礙,表現為譫妄,注意力,定向力障礙和書寫能力等受損;③臨床資料完整。(2)排除標準:①合并顱腦感染、腦血管疾病、腦占位性疾病、阿爾茨海默病及癲癇等顱內病變;②肝性腦病、肺性腦病、腎性腦病等其他器官功能障礙繼發的意識障礙;③甲狀腺危象,甲狀腺功能減退及糖尿病并發癥等能夠引起意識障礙的內分泌與代謝性疾病;④水電解質紊亂、精神疾病及藥物中毒等引起的意識障礙;⑤妊娠、哺乳期女性。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT的相對表達量檢測:患者入院后次日留取清晨空腹肘靜脈血5 ml,室溫靜置1 h,2 500 r/min離心10min,留取上層血清。利用外泌體RNA分離提取試劑盒(購自北京百奧萊博公司,貨號BTN180807)提取血清外泌體,取血清0.5 ml加入外泌體分離試劑0.1 ml,4℃室溫孵育30 min,離心去上清,加入緩沖液0.2 ml重懸。加入外泌體核酸提取溶液A 0.6 ml,混勻后靜置3 min,加入溶液B 0.7 ml,混勻后離心加入溶液C 1 ml,離心取上清后加入無酶水重懸外泌體總RNA 0.2 ml。逆轉錄為cDNA后,采用熒光定量PCR儀(美國ABI公司,型號ABI7500)檢測血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT的相對表達量,實時熒光定量PCR試劑盒購自北京索萊寶公司,貨號SR1110。引物由華大公司設計合成。PCR總反應體系20 μl:模板 0.5 μl,2×SYBR Green Premix 10 μl,正反向引物各1 μl,無酶水7.5 μl。反應程序:94℃ 預變性5 min、95℃變性30 s、62℃退火30 s、70℃延伸30 s,變性退火延伸共35個循環。引物序列:LncNEAT1正向序列5'-ACGGGCACACATCAAGCATA-3'、反向序列5'-AGCCTCAGCCCCCTATACAA-3',LncSOX2OT正向序列5'-GGGCTCTGTGGTCAAGTCCG-3'、反向序列5'-CGCTCTGGTAGTGCTGGGC-3';GAPDH正向序列5'-TGAGGCCGGTGCTGAGTATGTCG-3',反向序列:5'-CCACAGTCTTCTGGGTGGCAGTG-3'。2-ΔΔCt法對血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT的相對表達量進行定量分析。

1.3.2 SAE嚴重程度評估:對96例SAE患者應用急性生理學與慢性健康狀況評價Ⅱ (acute physiology and chronic health evaluationⅡ,APACHEⅡ)進行評分,范圍0～72分,分值越高,病情越重。根據入院24 h內呼吸系統、血液系統、肝臟系統等6個系統的相應參數,進行序貫器官衰竭評分(sequential organ failure assessment,SOFA評分),范圍0～24分,分值越高,病情越重。

2 結 果

2.1 2亞組臨床資料比較 死亡亞組SAE患者C反應蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、APACHEⅡ評分、SOFA評分高于生存亞組(P均<0.01),其他資料比較差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 生存亞組與死亡亞組SAE患者臨床資料比較

2.2 SAE組和非SAE組血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT表達比較 SAE組血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT相對表達量分別為(2.45±0.65)、(3.02±0.74),明顯高于非SAE組的(0.93±0.34)、(0.85±0.27)(t=16.726、21.803,P均<0.001)。

2.3 2亞組血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT表達比較 生存亞組血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT相對表達量分別為(1.82±0.59)、(2.52±0.69 ),明顯低于死亡亞組 (3.13±0.71 )、( 3.56±0.78)(t=9.861、6.931,P均<0.001)。

2.4 血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT表達與APACHEⅡ評分、SOFA評分相關性分析 Pearson相關系數分析結果顯示,SAE患者血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT與APACHEⅡ評分、SOFA評分呈明顯正相關(r=0.812,0.761,0.833,0.598,P均<0.001)。

2.5 SAE患者28 d生存預后的多因素Logistic回歸分析 以SAE患者28 d生存預后為因變量(死亡=1,生存=0),以上述結果中P<0.05項目為自變量進行多因素Logistic回歸分析,結果顯示,降鈣素原高、C反應蛋白高、神經元特異性烯醇化酶高、APACHEⅡ評分高、SOFA評分高、LncNEAT1高及LncSOX2OT高是影響SAE患者28 d生存預后的獨立危險因素(P<0.01),見表2。

表2 影響SAE患者28 d生存預后的多因素Logistic回歸分析

2.6 血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT對SAE患者28 d生存預后的評估價值 繪制血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT對SAE患者28 d生存預后的評估價值的ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結果顯示,血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT及二者聯合對SAE患者28 d生存預后診斷的AUC分別為0.846、0.834、0.914,二者聯合高于單項指標檢測 (Z=3.864、3.915,P均<0.001),見表3、圖1。

圖1 血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT及聯合對SAE患者28 d生存預后的評估價值ROC曲線

表3 血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT對SAE患者28 d生存預后的評估價值

3 討 論

SAE是膿毒癥常見的并發癥,患者致殘率、致死率較高[8]。SAE缺乏典型的臨床表現,目前無特異性生物標志物及影像學改變,其診斷過程仍為排除性診斷。目前認為SAE的發生與神經炎性反應、血腦屏障功能障礙及氨基酸和神經遞質異常有關[9]。雖然炎性反應及中樞神經系統損傷標志物如降鈣素原、神經元特異性烯醇化酶等標志物一定程度上能夠反映SAE患者病情程度,但在評估SAE患者預后方面仍存在敏感度及特異度不高等缺點,臨床應用價值有限[10]。深入研究SAE疾病機制,尋找能夠評估SAE預后的生物標志物,有利于SAE的早期診治,降低SAE死亡率。

外泌體是細胞釋放的直徑在幾十納米到幾百納米不等的磷脂雙分子層細胞外囊泡,能夠使核酸、蛋白等分子進行細胞間通訊[3]。近年來發現,膿毒癥患者血清外泌體中的核酸及蛋白等內容物可通過促進細胞死亡,參與SAE疾病的發生發展,是潛在的生物標志物[4]。LncNEAT1是近年來發現的新的非編碼RNA,其能夠加重膿毒癥患者炎性反應感染程度,導致多器官功能衰竭,是新的預后相關生物標志物[11]。本研究中,SAE患者血清外泌體LncNEAT1水平升高,與SAE病情程度有關,提示LncNEAT1參與膿毒癥患者SAE的疾病發生和發展。SAE患者血清外泌體LncNEAT1升高與患者機體炎性反應程度較重有關。研究表明,腫瘤壞死因子α、白介素1β等促炎細胞因子能夠誘導單核巨噬細胞中LncNEAT1的表達上調,LncNEAT1能夠以外泌體形式分泌到細胞外,進一步發揮促炎的生物學效應[11]。此外,LncNEAT1的水平升高能夠使神經細胞和腦微血管內皮細胞功能出現障礙,加重SAE患者病情嚴重程度。研究發現,膿毒癥小鼠血清外泌體中LncNEAT1表達升高,其作為分子海綿結合微小RNA-9-5p,上調轉鐵蛋白受體基因的表達,促進腦微血管內皮細胞株bEnd.3細胞的鐵死亡的發生,導致SAE疾病的發生發展[12]。尚有研究表明,膿毒癥小鼠神經細胞中lncNEAT1表達明顯增加,lncNEAT1能夠直接與血紅蛋白β亞單位相互作用,抑制突觸后密度蛋白95,降低神經元樹突棘密度,導致神經元功能障礙[5]。本研究中,血清外泌體LncNEAT1升高是SAE患者不良生存預后的獨立危險因素,提示檢測SAE患者血清外泌體LncNEAT1水平有助于評估患者臨床預后。分析其原因,一方面可能是LncNEAT1的表達能夠加重患者機體炎性反應程度,促進SAE患者病情進展。研究發現,在脂多糖誘導的膿毒癥小鼠模型中,LncNEAT1的表達上調能夠激活微小RNA-31-5p/POU結構域2類轉錄因子1通路,促進小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7釋放大量白介素1β、腫瘤壞死因子α等促炎細胞因子,加重膿毒癥疾病嚴重程度[13]。另一方面,LncNEAT1還能夠通過激活心肌細胞中Toll樣受體2/核因子κB信號通路,促進脂多糖誘導的膿毒癥小鼠心肌細胞凋亡,增加膿毒癥小鼠死亡率[14]。

LncSOX2OT編碼基因位于人類3號染色體,表達于發育中大腦皮質,參與調節神經干細胞的增殖和分化,與惡性腫瘤、中樞神經系統疾病的發生發展有關[15-16]。近年來發現,LncSOX2OT的異常表達上調能夠抑制細胞間黏附分子1的表達,促進人心肌細胞AC16的氧化應激反應和炎性反應損傷,促進心肌細胞凋亡[17]。本研究中,SAE患者血清外泌體LncSOX2OT升高,與病情程度呈正相關,表明LncSOX2OT促進SAE的疾病進展。LncSOX2OT的表達升高可能與rs9839776位點的單核苷酸多態性有關,rs9839776位點CC等位基因人群膿毒癥發生率顯著高于TT等位基因[18]。研究發現,脂多糖誘導的膿毒癥動物模型中,LncSOX2OT的表達上調能夠抑制SOX2的表達,促進線粒體分裂蛋白Drp1的表達升高,引起線粒體功能障礙,過度氧化應激及炎性反應導致認知功能障礙及SAE的發生[6,19]。本研究證實,血清外泌體LncSOX2OT水平能夠評估SAE患者的生存預后。其原因可能是LncSOX2OT能加重SAE患者病情嚴重程度,導致患者不良預后。有學者利用盲腸結扎穿孔術建立C57BL/6J雄性小鼠膿毒癥模型中發現,LncSOX2OT基因敲除可通過下調SOX2表達抑制膿毒癥誘導的小鼠海馬神經元凋亡,改善小鼠認知功能的損傷,抑制LncSOX2OT/SOX2信號通路可能是治療或預防膿毒癥相關性腦病神經退行性變的有效方法[20]。筆者進一步繪制ROC曲線,發現血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT聯合檢測對SAE患者生存預后具有較高的評估價值,診斷的敏感度和特異度分別為0.904,0.813。臨床醫生可根據血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT水平對SAE患者的預后進行評估,及早進行干預治療,從而改善SAE患者的預后。

綜上所述,老年SAE患者血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT水平升高,兩者表達與APACHEⅡ評分、SOFA評分呈正相關,均參與SAE的疾病進展。血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT水平升高是影響SAE患者28 d生存預后的獨立危險因素,兩項聯合對SAE患者28 d生存預后具有較高的預測價值。本研究也存在不足,本研究隨訪時間有限,未能對血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT水平在評估SAE患者長期認知功能障礙中的臨床價值進行深入研究,有待今后設計前瞻性多中心臨床試驗進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

李雪蓮:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;冷凌涵:實施研究過程,資料搜集整理;張麗涓:進行統計學分析;向相:課題設計,論文撰寫;宋家志:核對、整理資料,檢查數據;陳陶江:論文審核,論文修改;韓強:參與研究設計和試驗過程;王平:提出研究思路,分析試驗數據