血清外泌體和肺泡灌洗液miR-155及BMAL1基因在男性COPD合并失眠癥患者中的表達及與失眠的相關(guān)性

穆清爽,劉順,熱依拉·牙合甫,楊新玲

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種進行性呼吸道疾病,被認為是全世界最嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病之一[1]。COPD的具體發(fā)病機制尚不清楚,主要治療方法是改善COPD患者的癥狀,但不能延緩病情進展或降低病死率[2]。因此,需要對COPD的發(fā)病機制不斷進行新的探索以更好地提高COPD預(yù)后。目前研究發(fā)現(xiàn)多種微小核糖體核苷酸(micro RNA,miR)參與并影響了呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程,其中miR-155在肺癌、急性肺損傷、肺炎等疾病中均扮演重要角色[3]。除了呼吸系統(tǒng)癥狀及肺功能水平降低外,COPD患者大多伴有不同程度睡眠障礙。以往流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)COPD患者出現(xiàn)失眠癥的概率為35%～77%[4]。合并失眠癥的COPD患者更易產(chǎn)生焦慮、抑郁等負性情緒,日常生活及治療效果也會受到嚴(yán)重影響。關(guān)于COPD患者失眠癥的發(fā)生發(fā)展機制尚不明晰,其中“生物鐘”學(xué)說得到國內(nèi)外廣泛認可。生物鐘是機體一種內(nèi)源性的調(diào)控系統(tǒng),與人類睡眠質(zhì)量、睡眠時間及節(jié)律密切相關(guān)[5]。以往研究發(fā)現(xiàn)生物鐘相關(guān)調(diào)節(jié)基因眾多,其中腦和肌肉組織芳香烴受體核轉(zhuǎn)運蛋白的類似蛋白1(brain and muscle arnt-like protein1,BMAL1)基因與失眠的出現(xiàn)具有緊密聯(lián)系[6]。但miR-155及BMAL1 mRNA在COPD伴失眠的患者中表達特征尚不明晰。基于此,現(xiàn)分析miR-155及BMAL1 mRNA在COPD合并失眠癥患者中的表達水平及與失眠的相關(guān)性,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021年6月—2023年4月新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診治急性發(fā)作伴失眠的COPD患者60例作為觀察組,另外選取同期急性發(fā)作非失眠的COPD患者60例作為對照組。觀察組:年齡(53.97±3.42)歲;體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(23.27±2.77)kg/m2;COPD病程(14.56±4.22)年;每日吸煙(13.62±2.05)支,吸煙史(10.17±1.96)年;合并高血壓28例、合并糖尿病31例;COPD分級:Ⅰ級10例,Ⅱ級20例,Ⅲ級21例,Ⅳ級9例。對照組:年齡(53.98±3.96)歲;BMI(23.80±2.59)kg/m2;COPD病程(14.56±4.22)年;每日吸煙(13.07±2.20) 支,吸煙史(10.68±1.76)年;合并高血壓28例、合并糖尿病31例;COPD分級:Ⅰ級11例,Ⅱ級21例,Ⅲ級20例,Ⅳ級8例。2組患者臨床資料比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(K20210526-08),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①符合2021年GOLD指南中氣流嚴(yán)重程度分級為2級(中度)的COPD急性發(fā)作診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];②符合《失眠癥中醫(yī)臨床實踐指南(WHO/WPO)》中失眠的診斷標(biāo)準(zhǔn)且為首次診斷失眠癥[8];③年齡≥45歲的男性;④有明確、長期吸煙史。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①COPD發(fā)病前出現(xiàn)失眠癥狀與表現(xiàn)者;②合并嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙及心血管病、糖尿病等;③合并哮喘、肺氣腫及其他呼吸系統(tǒng)疾病;④藥物濫用者(尼古丁濫用除外);⑤合并睡眠呼吸暫停與其他睡眠障礙。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 樣品采集及保存:患者入院時采集空腹外周血10 ml,于室溫下離心留取上層血清,通過外泌體提取試劑盒(北京愛必信生物科技有限公司生產(chǎn),貨號 abs50035)提取血清中外泌體并經(jīng)BM-21AWY透射電子顯微鏡(寰熙醫(yī)療科技有限公司,型號BBF-4)確認,形態(tài)呈杯口狀,直徑40～150 nm。將提取好的外泌體及血清凍存于-80℃冰箱中待后續(xù)檢測。于患者入院第3天行支氣管鏡(徐州益柯達電子科技有限公司)肺泡灌洗術(shù)。將氣管鏡嵌入右肺或左肺上葉舌段的一個亞段,注入37℃的生理鹽水120 ml,采集研究對象的第2瓶肺灌洗回收液約50 ml;經(jīng)四層紗布過濾去除黏液和不溶性粉塵顆粒,4℃保存,分裝后高速離心,留取上清-80℃凍存待測。

1.3.2 miR-155及BMAL1 mRNA表達水平的檢測:上述血清外泌體和肺泡灌洗液上清采用qRT-PCR法檢測miR-155和BMAL1 mRNA表達水平。使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司生產(chǎn),貨號 15596026) 提取血清外泌體及肺泡上清液樣本中總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn),貨號 RP1105))將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA文庫,所有步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。應(yīng)用朗基Q2000B-實時熒光定量PCR儀(蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司生產(chǎn))及天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的多重PCR擴增試劑盒(貨號KT109)對miR-155、BMAL1及GAPDH內(nèi)參進行擴增,引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,見表1。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)采用德國QIAGEN公司生產(chǎn)的miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒,qRT-PCR每孔反應(yīng)體系為20 μl,包括樣本cDNA 2 μl、miScript SYBR Green Mix 10 μl、正向、反向引物(10 μmol/L)各0.8 μl、ddH2O為6.4 μl。qRT-PCR反應(yīng)體系設(shè)置為95℃ 5 min、95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s,采集信號,共設(shè)置45個循環(huán)。每份樣品均設(shè)置3個重復(fù)孔,通過2-△△CT法計算患者血清外泌體、肺泡灌洗液上清中miR-155及BMAL1 mRNA的相對表達水平。

表1 目標(biāo)基因及內(nèi)參基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 血清外泌體、肺泡灌洗液miR-155與BMAL1 mRNA水平比較 觀察組患者血清外泌體、肺泡灌洗液上清中miR-155及BMAL1 mRNA表達水平均高于對照組(P<0.01),見表2。

表2 2組COPD患者血清外泌體及肺泡灌洗液上清中miR-155、BMAL1 mRNA水平比較

2.2 miR-155、BMAL1 mRNA水平與失眠癥的相關(guān)性分析 將發(fā)生失眠癥賦值=1,未發(fā)生失眠癥賦值=0,通過Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)COPD患者血清外泌體、肺泡灌洗液上清中miR-155及BMAL1 mRNA水平與失眠癥的發(fā)生均存在顯著正相關(guān)性(P<0.01),見表3。

表3 COPD患者miR-155、BMAL1 mRNA水平與失眠癥的相關(guān)性分析

2.3 COPD患者失眠癥的危險多因素二元Logistic回歸分析 以COPD患者是否發(fā)生失眠癥為因變量,以COPD患者血清外泌體、肺泡灌洗液上清中miR-155及BMAL1 mRNA水平為自變量,進行二元Logistic回歸分析,結(jié)果表明:COPD患者血清外泌體、肺泡灌洗液上清中miR-155及BMAL1 mRNA水平增高均是發(fā)生失眠癥的獨立危險因素(P<0.05),見表4。

表4 Logistic回歸分析影響COPD患者預(yù)后的危險因素

2.4 miR-155及BMAL1 mRNA預(yù)測COPD患者失眠癥發(fā)生的價值分析 繪制miR-155及BMAL1 mRNA預(yù)測COPD患者失眠癥發(fā)生的價值ROC曲線,并計算AUC,結(jié)果顯示:COPD患者血清外泌體、肺泡灌洗液上清中miR-155及BMAL1 mRNA獨立及四項聯(lián)合預(yù)測失眠癥發(fā)生的AUC分別為0.679、0.706、0.719、0.733、0.839,四項聯(lián)合優(yōu)于各自單獨預(yù)測效能(Z=2.932、2.771、2.693、2.553,P均<0.001),見表5、圖1。

圖1 miR-155及BMAL1 mRNA對COPD患者失眠癥發(fā)生的預(yù)測價值ROC曲線

表5 miR-155及BMAL1 mRNA預(yù)測COPD患者失眠癥發(fā)生的價值比較

3 討 論

COPD是一種以持續(xù)氣流受限為特征的進行性呼吸系統(tǒng)疾病。空氣污染加重、吸煙時間增加、吸煙量增多等因素均會導(dǎo)致COPD發(fā)病率及嚴(yán)重程度增高,嚴(yán)重影響患者生命健康及日常生活,也為家庭和社會帶來沉重的醫(yī)療和經(jīng)濟負擔(dān)[9]。除了嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)癥狀和肺功能進行性降低外,COPD患者普遍存在不同嚴(yán)重程度的睡眠障礙。關(guān)于COPD患者失眠癥發(fā)生的具體機制尚不明晰,可能與患者夜間癥狀加重、持續(xù)負性情緒、反復(fù)憋喘等相關(guān)[10]。盡管臨床不斷提高對于COPD患者睡眠質(zhì)量的關(guān)注及干預(yù),但效果仍不理想。因此,及早預(yù)測COPD患者是否會發(fā)生失眠并在疾病早期進行對癥治療及藥物干預(yù)可能更有利于阻止COPD病情加重及合并癥的出現(xiàn)。而尋找特異度高、預(yù)測效能大的指標(biāo)也逐漸成為該領(lǐng)域的研究熱點[11-13]。

miRNA在COPD等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。其中,miR-155作為一種多功能miRNA,在免疫激活、炎性反應(yīng)、心血管疾病及呼吸系統(tǒng)疾病中均發(fā)揮一定作用[14]。以往研究發(fā)現(xiàn),miR-155可通過調(diào)節(jié)多種miRNAs及促炎性細胞因子的表達間接參與并調(diào)節(jié)哮喘、肺炎、肺結(jié)核、肺癌等多種肺部疾病[15]。此外,有研究發(fā)現(xiàn)老年COPD患者血清miR-155表達水平顯著增高,且急性加重期的患者增高幅度更明顯,提示血清miR-155水平與COPD的嚴(yán)重程度存在相關(guān)性[16]。由于miR-155大多參與并調(diào)節(jié)不同疾病的炎性反應(yīng)過程,因此其在COPD中的作用可能也與調(diào)控炎性因子水平相關(guān)。睡眠節(jié)律相關(guān)基因是調(diào)控人體睡眠—覺醒活動的主要基因,也被稱為生物鐘相關(guān)性基因。人類的生物鐘系統(tǒng)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,主要由視上核交叉(suprachiasmatic nucleus,SCN)和附屬的外周生物鐘系統(tǒng)組成[17]。目前國內(nèi)外研究確認的生物鐘基因成分包括Clock、BMAL1、Cry1、Cry2、Per1、Per2及Per3等[18-19]。以往研究發(fā)現(xiàn),在睡眠剝奪的小鼠模型中,SCN組織內(nèi)BMAL1基因、蛋白水平均顯著升高,提示了BMAL1與失眠發(fā)生的相關(guān)性[20]。本研究發(fā)現(xiàn),合并失眠癥的COPD患者無論血清外泌體還是肺泡灌洗液上清中miR-155及BMAL1 mRNA的表達水平均顯著較高,且經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析及建模發(fā)現(xiàn)miR-155及BMAL1對于預(yù)測COPD患者失眠發(fā)生均具有較好的效能。分析原因,miR-155參與COPD患者失眠發(fā)生的過程可能與促進肺臟及氣道持續(xù)性炎性反應(yīng)水平增高有關(guān)。miR-155在血清及肺泡灌洗液中表達水平增高導(dǎo)致局部促炎性細胞因子分泌增加、抑炎性細胞因子減少,加重了COPD患者氣道反應(yīng)性及炎性反應(yīng)微環(huán)境,進而導(dǎo)致患者癥狀加重并影響睡眠[21]。BMAL1基因作為SCN中2類興奮性調(diào)節(jié)基因,不論其轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白表達增高均可能引起神經(jīng)興奮性增強,從而導(dǎo)致患者入睡困難、睡眠質(zhì)量降低及睡眠時間減少,而持續(xù)性的神經(jīng)興奮增強必然導(dǎo)致失眠癥的發(fā)生。同時,COPD患者由于癥狀加重或夜間急性發(fā)作導(dǎo)致正常睡眠終止,這種由于疾病本身引起的晝夜節(jié)律紊亂也可能反向?qū)е翨MAL1基因表達的失衡。此外,BMAL1基因作為重要的生物鐘基因,可調(diào)控生命周期和器官衰老的多種途徑,當(dāng)BMAL1表達紊亂時,可能導(dǎo)致COPD患者肺部炎性反應(yīng)水平增高、中性粒細胞浸潤加重及氣道上皮細胞、肺內(nèi)皮細胞等多種細胞代謝及再生紊亂[22]。

本研究也存在一定局限性。由于受到實際醫(yī)療條件及倫理學(xué)的要求限制,無法直接檢測入組患者腦部或SCN組織中miR-155及BMAL1的轉(zhuǎn)錄水平特征。其次,在多種生物鐘相關(guān)基因中,僅選擇了最具有代表性、與失眠發(fā)生相關(guān)性較顯著的BMAL1基因作為主要觀察指標(biāo),Cry、Per等基因在合并失眠癥的COPD患者體內(nèi)表達水平變化仍未可知。基于以上不足,后續(xù)將收集相關(guān)標(biāo)本并篩選其他可能與COPD患者失眠發(fā)生相關(guān)的潛在靶點基因。盡管如此,本研究發(fā)現(xiàn)COPD患者血清外泌體及肺泡灌洗液中miR-155及BMAL1水平升高與失眠癥的發(fā)生顯著相關(guān),提示miR-155及BMAL1可能參與COPD相關(guān)性失眠的發(fā)生、發(fā)展過程,為未來進一步探究COPD患者失眠的神經(jīng)病理機制提供潛在靶點。

利益沖突：所有作者均聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

穆清爽:設(shè)計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;劉順:實施研究過程,分析試驗數(shù)據(jù);熱依拉·牙合甫:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改,進行統(tǒng)計學(xué)分析;楊新玲:課題設(shè)計,論文撰寫