TOP2A聯(lián)合miR-21檢測(cè)在宮頸癌病情及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值

萬(wàn)晶晶,姚莉,李夢(mèng)琳,甘艷玲,汪晶

宮頸癌(cervical cancer)的發(fā)病機(jī)制與癌基因及微小RNA(miRNA)等表達(dá)異常有關(guān),越來(lái)越多的研究證實(shí)癌基因與miRNA可作為宮頸癌病情及預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物,其敏感度及特異度高于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物及FIGO分期[1-2]。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα(topoisomerase Ⅱα,TOP2A)在DNA分裂、修復(fù)重組、轉(zhuǎn)錄等過(guò)程中具有調(diào)節(jié)DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)功能,研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者TOP2A表達(dá)顯著升高且與臨床病理因素相關(guān)[3]。miR-21具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等惡性生物學(xué)行為,研究發(fā)現(xiàn)miR-21在宮頸癌中表達(dá)顯著升高[4]。目前TOP2A及miR-21在宮頸癌病情及預(yù)后評(píng)估中的臨床價(jià)值尚無(wú)相關(guān)研究。因此,現(xiàn)分析TOP2A聯(lián)合miR-21在宮頸癌病情及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性收集2015年1月—2016年12月武漢市第三醫(yī)院和武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科診治的宮頸癌患者80例為CVC組,另選擇同期宮頸良性疾病(包括宮頸息肉、慢性宮頸炎等)患者45例為對(duì)照組(CON組)。2組患者在年齡、病程、卡氏評(píng)分、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、高血壓、糖尿病、家族史、宮頸炎、HPV感染等方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),具有可比性,見(jiàn)表1,本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(2015011),患者及家屬知情同意并簽署知情同意書(shū)。

表1 CVC組與CON組患者臨床資料比較

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)影像學(xué)、宮頸活檢或手術(shù)病理組織學(xué)檢查確診;②首次診治,既往無(wú)宮頸癌病史且未行手術(shù)、放療、化療及靶向藥物等治療;③卡氏評(píng)分≥70分,預(yù)計(jì)生存期≥3個(gè)月,臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他腫瘤、嚴(yán)重心肺血管病及子宮繼發(fā)性良惡性腫瘤、精神神經(jīng)疾病等。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 miR-21、TOP2A表達(dá)檢測(cè):CVC組患者取腫瘤組織及癌旁組織,CON組患者取宮頸組織。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)法檢測(cè)宮頸癌腫瘤組織、癌旁組織、宮頸組織miR-21及TOP2A表達(dá),其中miR-21上游引物序列為5’-GCTTATCAGACTGATGTTG-3’,下游引物序列為5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’;TOP2A上游引物序列為5’-CTAGTTAATGCTGCGGACAACA-3’,下游引物序列為5’-CATTTCGACCACCTGTCACTT-3’。提取各組組織總RNA純化并定量,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后行PCR擴(kuò)增(大連寶生物工程公司),反應(yīng)體系為25 μl,反應(yīng)條件為:45℃孵育15 min,95℃預(yù)變性1 min;55℃退火1 min,68℃延伸擴(kuò)增1 min,30個(gè)循環(huán),最后一輪72℃反應(yīng)5 min。TOP2A選擇GAPDH為內(nèi)參,miR-21選擇U6為內(nèi)參,分別采用2-△△Ct計(jì)算TOP2A、miR-21相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR相關(guān)試劑購(gòu)自大連寶生物工程公司,PCR儀器購(gòu)自美國(guó)ABI公司(型號(hào)HT9700)。

1.3.2 預(yù)后隨訪:CVC組宮頸癌患者每3個(gè)月電話或門診隨訪1次,內(nèi)容包括:生存質(zhì)量、腫瘤標(biāo)志物、治療狀況及生存狀況。隨訪時(shí)間至2023年4月(隨訪終點(diǎn))。統(tǒng)計(jì)患者1年預(yù)后(死亡、復(fù)發(fā)、進(jìn)展、繼發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥定義為預(yù)后不良)、總生存期及預(yù)后終點(diǎn)事件(死亡或存活)。

2 結(jié) 果

2.1 TOP2A及miR-21表達(dá)比較 CVC組患者腫瘤組織TOP2A及miR-21表達(dá)均顯著高于癌旁組織及CON組(P<0.01)。癌旁組織與CON組TOP2A及miR-21表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表2。

表2 CON組和CVC組TOP2A及miR-21表達(dá)比較

2.2 TOP2A及miR-21表達(dá)在不同臨床/病理因素中差異比較 CVC組腫瘤組織TOP2A及miR-21表達(dá)在年齡、HPV感染及病理類型方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),分化程度低分化、組織學(xué)分級(jí)G3、肌層浸潤(rùn)深度≥1/2、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ⅲ+Ⅳ期患者TOP2A及miR-21表達(dá)顯著高于分化程度中—高分化、組織學(xué)分級(jí)G1+G2、肌層浸潤(rùn)深度<1/2、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ⅰ+Ⅱ期患者(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 宮頸癌腫瘤組織TOP2A及miR-21表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

2.3 預(yù)后情況 CVC組宮頸癌患者隨訪至終點(diǎn)(2023年4月)死亡52例,存活28例;疾病進(jìn)展(包括復(fù)發(fā))56例;繼發(fā)直腸陰道漏12例、膀胱陰道漏9例、Ⅳ度骨髓抑制25例、Ⅳ度肝腎功能損傷21例。

2.4 TOP2A、miR-21與宮頸癌生存期關(guān)系 CVC組宮頸癌TOP2A≥1.82且miR-21≥1.36患者中位生存期(31.4±5.5)個(gè)月低于TOP2A<1.82或miR-21<1.36患者(39.6±6.2)個(gè)月(Logrank=8.645,P=0.003)。

2.5 TOP2A及miR-21預(yù)測(cè)宮頸癌1年預(yù)后不良效能分析 繪制TOP2A及miR-21預(yù)測(cè)宮頸癌1年預(yù)后不良ROC曲線,并計(jì)算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示,TOP2A、miR-21及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)宮頸癌1年預(yù)后不良的AUC分別為0.815、0.831、0.927,二者聯(lián)合的AUC最大(Z/P=2.542/0.018、2.218/0.021),見(jiàn)表4、圖1。

圖1 TOP2A、miR-21預(yù)測(cè)宮頸癌1年預(yù)后不良ROC曲線

表4 TOP2A及miR-21預(yù)測(cè)宮頸癌1年預(yù)后不良效能比較

2.6 宮頸癌患者死亡危險(xiǎn)因素分析 以宮頸癌患者是否死亡為因變量(賦值:是為“1”;否為“0”),以表3中P<0.05項(xiàng)目為自變量,進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,分化程度低分化、組織學(xué)分級(jí)G3、肌層浸潤(rùn)深度≥1/2、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期Ⅲ+Ⅳ期、TOP2A表達(dá)≥1.82、miR-21表達(dá)≥1.36為宮頸癌死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見(jiàn)表5。

表5 宮頸癌患者死亡危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析

3 討 論

TOP2A識(shí)別DNA結(jié)構(gòu)后形成復(fù)合物可打斷并重新連接DNA雙鏈,在DNA分裂、修復(fù)重組、轉(zhuǎn)錄等生理過(guò)程中具有調(diào)節(jié)DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)功能[5]。TOP2A在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等惡性生物學(xué)行為中具有重要作用,在宮頸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)且與其惡性程度及FIGO分期相關(guān)[3]。TOP2A自身或作為其他基因調(diào)節(jié)靶標(biāo)參與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)TOP2A基因可通過(guò)靶向調(diào)控PI3K/AKT等信號(hào)通路調(diào)控宮頸癌細(xì)胞遷移及侵襲[8]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織TOP2A基因mRNA及蛋白表達(dá)均顯著上調(diào),與宮頸癌惡性程度及FIGO分期相關(guān),TOP2A基因高表達(dá)宮頸癌患者預(yù)后及生存期差于低表達(dá)患者[9-10]。基于目前的研究進(jìn)展推測(cè)TOP2A在宮頸癌病情及預(yù)后評(píng)估中可能具有重要價(jià)值,可作為宮頸癌病情及預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物。本研究中,宮頸癌患者腫瘤組織TOP2A表達(dá)顯著高于癌旁組織及宮頸良性疾病患者,證實(shí)TOP2A基因與宮頸癌發(fā)病機(jī)制存在關(guān)聯(lián)。本研究進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TOP2A表達(dá)與分化程度、組織學(xué)分級(jí)、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期、生存期及死亡風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān),表明TOP2A可作為宮頸癌病情及預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物。

miRNA為內(nèi)源性非編碼單鏈RNA,主要是通過(guò)降解mRNA或抑制蛋白質(zhì)翻譯來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá),在細(xì)胞增殖、凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11-14]。研究發(fā)現(xiàn),miRNA表達(dá)異常與宮頸癌發(fā)生與發(fā)展有關(guān),宮頸癌患者可檢測(cè)到miRNA表達(dá)異常,在宮頸癌病情及預(yù)后評(píng)估、臨床診療中具有重要作用[15-16]。miR-21可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等惡性生物學(xué)行為,在多種惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制、病情及預(yù)后評(píng)估中具有重要價(jià)值[17-20]。研究發(fā)現(xiàn)miR-21與宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)[21]。miR-21與局部進(jìn)展期宮頸癌放療不敏感相關(guān)[22]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miR-21在宮頸癌患者中表達(dá)顯著升高,且與病情及預(yù)后相關(guān)[23-24]。本研究中,宮頸癌患者腫瘤組織miR-21表達(dá)顯著高于癌旁組織及宮頸良性疾病患者,表明miR-21與宮頸癌發(fā)病機(jī)制相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-21表達(dá)與分化程度、組織學(xué)分級(jí)、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO分期、生存期及死亡風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān),表明miR-21在宮頸癌病情及預(yù)后評(píng)估中具有重要價(jià)值。

目前宮頸癌病情及預(yù)后評(píng)估常用的方法包括腫瘤標(biāo)志物、影像學(xué)檢查及FIGO分期等,前者存在敏感度及特異度低等缺點(diǎn)(目前報(bào)道的敏感度及特異度均在0.6～0.8),后者存在受檢查者主觀因素影響大、可重復(fù)性及普適性差等缺點(diǎn),尤其不適用于無(wú)法取得明確病理分期患者,故探討新型高效安全的基因水平標(biāo)志物更具有臨床價(jià)值[25-26]。隨著對(duì)宮頸癌發(fā)病機(jī)制的深入研究及基因檢測(cè)水平的提高,基因水平的標(biāo)志物可能在宮頸癌病情及預(yù)后評(píng)估中具有更高的敏感度及特異度,具有檢測(cè)快捷方便等優(yōu)點(diǎn)[27-28]。本研究中TOP2A、miR-21預(yù)測(cè)宮頸癌1年預(yù)后不良的AUC、敏感度及特異度高于目前報(bào)道的分化程度、組織學(xué)分級(jí)、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO分期,尤其是TOP2A聯(lián)合miR-21檢測(cè)時(shí)AUC、敏感度及特異度顯著升高,表明TOP2A聯(lián)合miR-21檢測(cè)在宮頸癌病情及預(yù)后評(píng)估中的臨床價(jià)值高于傳統(tǒng)的檢測(cè)指標(biāo)。

綜上所述,宮頸癌患者TOP2A及miR-21表達(dá)顯著升高,與分化程度、組織學(xué)分級(jí)、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期相關(guān),可作為宮頸癌病情及預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物。TOP2A聯(lián)合miR-21檢測(cè)可顯著提高預(yù)測(cè)宮頸癌預(yù)后不良的敏感度及特異度。值得注意的是,本研究中TOP2A及miR-21依賴于病理標(biāo)本的檢測(cè)仍存在普適性差等缺點(diǎn),不依賴于病理標(biāo)本的血清學(xué)TOP2A及miR-21可能更具有臨床價(jià)值。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

萬(wàn)晶晶、甘艷玲:實(shí)施研究過(guò)程,資料搜集整理,論文修改;姚莉:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;李夢(mèng)琳:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;汪晶:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過(guò)程,論文撰寫(xiě)