土地利用類型對土壤氨氧化微生物豐度和群落結構的影響

朱飛，李文波，田磊，沈洪偉，季敬敬，魏元甲，王蕓，王欣麗

(1. 臨沂市農業農村局，山東臨沂 276000；2. 臨沂市農業科學院，山東臨沂 276000；3. 山東省水土保持與環境保育重點實驗室/臨沂大學資源環境學院，山東臨沂 276005)

硝化作用是土壤氮轉化的一個重要步驟，它不僅關系到礦化釋放的銨態氮或外源銨態氮在土壤氮循環中的轉化，還與土壤氮的損失有關；所涉及的過程關聯著土壤酸化、水體富營養化以及溫室氣體N2O 排放等環境問題[1]。 因此，硝化作用一直是氮轉化過程中一個備受關注的環節。 氨氧化是硝化作用的第一步也是限速步驟，氨氧化細菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)被認為是氨氧化作用的主要執行者[2]。 由于AOA、AOB 等功能群體對環境因子(如氧氣和底物等)具有不同的響應特征，因此不同的土壤類型和土地利用類型下不同功能群的生態位會發生變化。

AOA 和AOB 在生理和代謝途徑上存在很大差異[3-4]，包括其對土壤pH 值[5]、土壤有機質含量[6]和氨濃度[7]等的適應，導致土壤中氨氧化微生物不同的群落結構和功能。 研究表明土壤pH值影響硝化作用底物的化學形態和生物可利用性，在AOA 和AOB 的生態位分異中起著重要作用[8]。 與AOB 相比，AOA 對底物NH3有更高的親和力[9]，高氮土壤更利于AOB 的增長[10]。 有機質含量也是影響AOA 和AOB 相對競爭優勢的重要因素[6-7，10]。 土壤有機質一方面會刺激具有混合營養能力的AOA，另一方面其礦化釋放的氨會促進AOA 豐度的增加[6]。

不同的土地利用和管理模式對土壤的屬性和環境可產生劇烈影響，導致土壤理化性質和微生物活性發生改變[11-14]。 天然土地轉化成農業用地后利用強度提高，尤以設施蔬菜地土壤的利用程度最高，具有無機和有機肥料投入量高、種植強度大等特點[15]。 不同利用方式土壤在pH 值、氮素狀況等方面的差異必然影響AOB、AOA 的豐度和群落組成。 前人研究多數針對酸性土壤，關于原堿性土壤不同干擾程度下的土地利用氨氧化微生物是如何響應的研究很少。 本研究選取褐土林地、農田和設施蔬菜地3 種中國北方常見土地利用類型的土壤，代表不同的干擾程度(林地＜農田＜設施蔬菜地)，采用熒光定量PCR 和Illumina MiSeq 高通量測序技術，研究不同土地利用類型土壤AOA 和AOB 的豐度、多樣性和群落結構的變化，探討土壤理化性質變化對氨氧化微生物群落組成的影響以及氨氧化微生物對環境的長期適應性，以期為土壤肥力提升和土地的合理利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究區與土壤樣品采集

土壤樣品采集自山東省沂南縣(35°36′28″N，118°22′4″E)，屬暖溫帶大陸性季風氣候，全年平均氣溫13.7 ℃，年均降水量856 mm。 最冷月份為1 月，平均氣溫為-0.8 ℃；最熱月份為7 月，平均氣溫為26.4 ℃。 土壤類型屬于褐土，起源于石灰巖。 選取3 種鄰近(相距1 km 內)但不同的土地利用類型土壤作為研究對象，分別是林地、農田和設施蔬菜地。 林地是人工林(大約20 年)，主要樹種是毛白楊(Populus tomentosaCarr.)；農田種植時間大于30 年，主要是小麥(Triticum aesti-vumL.)和玉米(Zea maysL.)輪作，每年施氮量350～450 kg/hm2；設施蔬菜地主要種植黃瓜(Cucumis sativusL.)，種植時間為10 年以上，每年施氮量800～900 kg/hm2。

土壤樣本于2017 年5 月采集。 每個采樣點設3 次重復，每個重復樣本由5 份隨機采集的0～20 cm 土壤混合而成。 采集的新鮮土樣置于冰上運回實驗室，去除植物根系和石塊后過2 mm 篩，一部分儲存在-80 ℃冰箱，用于amoA基因群落豐度和結構分析，另一部分用于理化性質分析。

1.2 土壤理化性質測定

理化性質測定參考魯如坤[16]的方法。 土壤pH 值采用電極法測定，水土比為2.5∶1(v/m)。土壤有機碳(SOC)含量測定采用硫酸-重鉻酸鉀氧化法。 土壤全氮(TN)含量測定用半微量凱氏定氮法。 銨態氮和硝態氮含量測定時首先用2 mol/L KCl 溶液浸提，然后用SkalarplusSan 流動分析儀測定。

1.3 DNA 提取及熒光定量PCR

土壤總DNA 的提取采用FastDNA?SPIN Kit for soil (MP Biomedicals，USA)試劑盒進行，具體操作方法參照說明書。 將提取的土壤總DNA 溶解于100 μL TE buffer 中。 用Nanodrop (ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer Therom，USA) 檢測DNA 的純度和濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其片段大小，置于-20 ℃冰箱保存。

以AOA 和AOBamoA基因的重組質粒作為標準DNA 模板，經10 倍連續稀釋，制作標準曲線。用SYBRPremix Ex TaqTMKit(TaKaRa)試劑盒，分別以Arch-amoAF/Arch-amoAR[17]和amoA-1F/amoA-2R[18]為引物，在CFX96 Real-Time PCR System(Bio-Rad，USA)實時熒光定量PCR 儀上進行擴增，定量分析AOA 和AOB 的amoA基因拷貝數。 qPCR 反應體系(20 μL):2×SYBR Premix Ex PCR buffer 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，DNA 模板1 μL。 qPCR 擴增程序:95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；40 個循環。

1.4 Illumina MiSeq 測序

采用PCR 擴增AOA 和AOBamoA基因，擴增引物和反應體系同1.3，擴增條件為:94 ℃5 min；95 ℃30 s，55 ℃45 s，72 ℃45 s，35 個循環；72 ℃7 min。 以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物。 樣品送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，運用Illumina MiSeq 測序平臺進行測序。 序列用FLASH 合并，利用微生物生態學(Qiime)軟件對所得序列進行過濾、拼接和去除嵌合體。 OTU 按照97%進行聚類分析。 利用RDP 分類器對每條序列進行物種分類注釋，比對fgr/amoA 數據庫，置信閾值為70%。 利用Mothur 1.30.1 軟件在97%相似水平上對氨氧化微生物群落α 多樣性指數進行分析。

1.5 數據處理與分析

采用SPSS 19.0 軟件對土壤理化性質、氨氧化微生物豐度和群落α 多樣性指數進行差異顯著性分析(P＜0.05)和Pearson 相關性分析。 采用CANOCO 4.5.1 軟件(Microcomputer Power，Ithaca，USA) 開展CCA 分析，明確AOA 和AOB 群落結構和土壤理化因子間的關系。 利用Origin(OriginPro 9.0 for Windows)軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同土地利用類型土壤理化性質

由表1 可知，林地土壤呈堿性，其pH 值在褐土的常見值范圍內；農田和設施蔬菜地土壤呈酸性，其中設施蔬菜地的pH 值最低(5.32)。 林地土壤的有機碳和全氮含量最高，農田土壤最低。設施蔬菜地中銨態氮、硝態氮含量顯著高于林地和農田，農田中的硝態氮含量顯著高于林地土壤。

表1 不同土地利用類型土壤理化性質

2.2 不同土地利用類型土壤AOA 和AOB 的豐度

由圖1 可以看出，林地土壤AOAamoA基因豐度顯著高于農田和設施蔬菜地，農田和設施蔬菜地土壤間無顯著差異。 AOBamoA基因豐度為4.99×106～2.81×107copies/g；農田土壤豐度顯著高于設施蔬菜地和林地(P＜0.05)，林地土壤基因豐度最低。

圖1 不同土地利用類型土壤AOA 和AOB amoA 基因豐度

2.3 不同土地利用類型土壤AOA 和AOB 的α多樣性指數

如表2 所示，所有樣品AOA 和AOBamoA基因的測序覆蓋度在0.9991 ～0.9996。 不同土地利用類型對AOA 和AOB Shannon 指數均有影響，農田土壤AOA 和AOB Shannon 指數均最高，設施蔬菜地AOA Shannon 指數最低，林地和設施蔬菜地AOB Shannon 指數較低，且兩者無顯著差異。 不同土地利用類型對AOA Simpson 指數無顯著影響；林地和設施蔬菜地中AOB 的Simpson 指數顯著高于農田土壤。 設施蔬菜地土壤AOA 的ACE 指數和Chao1 指數顯著低于林地和農田，而AOB 的ACE指數和Chao1 指數在3 種土壤中無顯著差異。

表2 不同土地利用類型土壤氨氧化微生物群落α 多樣性指數

2.4 AOA 和AOB amoA 基因豐度和群落α 多樣性指數與土壤理化性狀的相關性分析

相關性分析結果(表3)表明，AOAamoA基因豐度與土壤有機碳含量、pH 值呈顯著正相關(P＜0.01)，與硝態氮含量呈顯著負相關(P＜0.05)；AOBamoA基因豐度與有機碳和全氮含量呈顯著負相關(P＜0.01)。

表3 土壤理化性狀與amoA 基因豐度和α 多樣性指數的相關性

AOA 群落的Shannon 指數與土壤全氮含量呈顯著負相關(P＜0.05)；Simpson 指數與有機碳和全氮含量呈顯著正相關(P＜0.05)；ACE 指數和Chao1 指數與硝態氮含量呈顯著負相關(P＜0.05，P＜0.01)，Chao1 指數與pH 值呈顯著正相關(P＜0.05)。 AOB 群落的Shannon 指數與有機碳和全氮含量呈顯著負相關(P＜0.01)；Simpson 指數與有機碳和全氮含量均呈顯著正相關(P＜0.01)；ACE 指數與pH 值呈顯著正相關(P＜0.05)，和硝態氮含量呈顯著負相關(P＜0.05)。

2.5 不同土地利用類型對AOA 和AOB 群落的影響

在門水平上，AOA 群落由奇古菌門(Thaumarchaeota)、泉古菌門(Crenarchaeota)、 Unclassified_k_norank_d_Archaea 和Environmental_samples_k_norank_d_Archaea 組成(圖2a)。 泉古菌門在林地和農田中為主要優勢類群，相對豐度分別為79.94%和58.95%，在設施蔬菜地中僅占13.03%；奇古菌門在設施蔬菜地中為主要優勢類群，相對豐度為66.80%，在林地和農田中分別為3.05%和31.19%。 在屬水平上，共檢測到5 個類群(圖2b)，分別為Environmental_samples_p_Crenarchaeota、亞硝化球菌屬(Nitrososphaera)、Environmental_samples_p_Thaumarchaeota、Unclassified_k_norank_d_Archaea、Environmental_samples_k_norank。Nitrososphaera只分布在農田和設施蔬菜地中，相對豐度分別為19.54%和66.60%。

圖2 不同土地利用類型土壤AOA 門(a)和屬(b)水平的群落組成

3 種土地利用類型的AOB 在門水平上包括變形菌門(Proteobacteria)、Unclassified_k_norank_d_Bacteria、Environmental_samples_k_norank 和Ammonia_oxidsing_bacteria_ensemble(圖3a)。 變形菌門在林地和農田中為主要優勢類群，分別占83.52%和95.11%；在設施蔬菜地中占23.10%。設施蔬菜地中Unclassified_k_norank_d_Bacteria和Environmental_samples_k_norank 為優勢類群，分別占44.20%和32.68%。 在屬水平上檢測到5個類群，分別是亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)、Norank_p_environmental_samples、Unclassified_k_norank_d_Bacteria、Unclassified_o_Nitrosomonadales和其他(圖3b)。 已知屬為Nitrosospira，在農田和設施蔬菜地中分別占83.47%和12.35%。

圖3 不同土地利用類型土壤AOB 門(a)和屬(b)水平的群落組成

2.6 AOA 和AOB 群落結構與土壤理化性質的關系

對AOA 和AOB 群落結構與環境變量進行典型對應分析(CCA)，結果(圖4)表明，AOA 的第一、二坐標軸(CCA1 和CCA2)分別解釋了52.5%和22.2%的變異，全氮(TN)含量和土壤pH 值顯著影響AOA 的群落結構。 AOB 的第一、二坐標軸分別解釋了55.1%和21.1%的變異，土壤pH 值和SOC 含量顯著影響AOB 的群落結構。不同土地利用類型土壤AOA 和AOB 群落均明顯分開。

圖4 AOA(a)和AOB(b)群落結構與土壤理化性質的CCA 分析

3 討論與結論

不同土地利用類型顯著影響AOA 和AOB 的群落豐度。 林地土壤AOA 豐度顯著高于農田和設施蔬菜地，原因可能與森林土壤較高的有機質含量和低氨濃度有關。 研究表明根系分泌物[19]和凋落物[20]促進了AOA 的顯著生長，證明了有機質對AOA 生長的重要性。 豐富的有機質一方面會促進AOA 的增長；另一方面，在自然條件下，通過有機物礦化，以持續的低速率產生的氨可利用性很低，有利于對氨親和力較高的AOA 的生長[6，21]。 與之形成對比，農田和設施蔬菜地土壤中AOB 豐度顯著高于林地。 AOB 對氨的親和力較低，森林有機質礦化過程緩慢釋放的并不足以支持其大量生長，因此其只在大量施肥的農田和設施蔬菜農地中具有較高豐度[7，22]。Zhong 等[23]也發現密集施肥的設施蔬菜地土壤中AOB 占優勢。 大量研究表明，土壤pH 值是影響硝化微生物豐度和組成的關鍵因子之一[5，8]，農田和設施蔬菜地由于長期施肥導致土壤pH 值下降。 Chen 等[24]研究認為，土壤pH 值與AOB 數量呈顯著負相關，與AOA 數量沒有顯著相關關系。 然而，楊亞東等[25]研究認為，土壤pH 值與AOA 數量顯著正相關，與AOB 數量沒有顯著相關關系，這與本研究結果相同。 因此，在復雜的土壤環境中，pH 值不總是影響AOA 和AOB 分異的決定性因子。

不同土地利用類型土壤AOA 和AOB 的α多樣性不同，農田土壤AOA 和AOB 的Shannon 指數顯著高于設施蔬菜地土壤，且與土壤全氮含量呈顯著負相關，說明設施蔬菜地土壤由于施氮量增加而降低了土壤AOA 和AOB 的多樣性。 該結果與Wang[26]、周晶[27]等的研究結論一致。 適量施用氮肥能提高AOA 和AOB 的多樣性，但長期大量施用氮肥則不利于保持多樣性。

在門分類水平上，林地和農田土壤AOA 主要優勢類群是泉古菌門，設施蔬菜地土壤AOA 優勢類群為奇古菌門。 趙輝等[28]研究發現，設施蔬菜地隨著種植年限的增加，奇古菌門的相對豐度增大，說明長期大量施肥有利于奇古菌門AOA 的生長。 相比林地土壤，農田和設施蔬菜地土壤里的已知屬Nitrososphaera在AOA 功能群中的占比更高，并在設施蔬菜地的AOA 類群中占據顯著優勢。 這一結果與早期研究結論[29]并不一致。 而近期研究發現，酸性土壤中主導硝化的AOA 類群屬于Nitrososphaera viennensisEN76 相關類群，并且其活性源于對酸性環境的耐受性，而非對氨的高度親和力(如在偏堿性森林土中)[30-31]。

AOB 中的變形菌門在林地和農田中為主要優勢類群，而在設施蔬菜地中僅占23.10%，這可能與變形菌門適合的營養閾值有關[32]。 設施蔬菜地與農田相比，由于養分大量富集，超過了變形菌門的生態閾值，對其生長起到了抑制作用。 已知屬Nitrosospira是農業施肥土壤中最常見的一類硝化細菌[33]，Chu 等[34]的研究結果也表明施氮肥會導致NitrosospiraCluster 3 的競爭優勢，但是Nitrosospira更喜歡低氨的環境[35]，因此在施氮量高的設施蔬菜地中所占比例(12.35%)遠低于農田(83.47%)。

CCA 分析表明土壤pH 值、全氮和銨態氮含量顯著影響AOA 的群落結構，解釋了不同土地利用類型中74.7%的AOA 群落組成差異。 土壤pH值、有機質含量顯著影響了AOB 的群落結構，解釋了不同土地利用類型中76.2%的AOB 群落組成差異。 說明林地轉變為農業用地后，在作物種植和施肥管理過程中，土壤酸化、氮肥積累和有機肥使用等因素直接影響了土壤的理化性質，從而決定了AOA 和AOB 群落結構的變化[36-37]。