基于SSR 標(biāo)記的100 份國內(nèi)外小麥種質(zhì)遺傳多樣性分析及DNA 指紋圖譜構(gòu)建

王健勝侯桂玲王二偉馬愛鋤程世平

(1. 平頂山學(xué)院，河南平頂山 467000；2. 河南省生態(tài)經(jīng)濟(jì)型木本植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南平頂山 467000；3. 平頂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南平頂山 467001)

小麥(Triticum aestivumL.)具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，我國從北方到南方均有種植，具有分布范圍廣、栽培面積大、總產(chǎn)量高等特點(diǎn)，是我國的主要糧食作物之一，對保障國家糧食安全具有重要戰(zhàn)略意義[1]。 優(yōu)良的品種是保障我國小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要基礎(chǔ)。 但在育種實(shí)踐中，為了獲得農(nóng)藝性狀優(yōu)良的小麥品種，育種工作者習(xí)慣于過分注重對少數(shù)優(yōu)良小麥種質(zhì)的利用，這使得育成小麥種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)日益狹窄，小麥育種水平及進(jìn)度提高緩慢，故種質(zhì)資源研究作為小麥新品種選育的重要基礎(chǔ)性工作越來越受到科研工作者的重視[2-3]。 因此，開展種質(zhì)遺傳多樣性分析，掌握現(xiàn)有種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)及親緣關(guān)系，發(fā)掘并利用優(yōu)異種質(zhì)材料，對拓寬小麥育種的遺傳基礎(chǔ)、加快育種進(jìn)程和提高育種水平具有重要意義。

已有學(xué)者開展了小麥遺傳多樣性研究[4-8]，如張凡等[4]對620 份小麥種質(zhì)農(nóng)藝性狀的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其在質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀上均具有豐富的遺傳多樣性，并據(jù)此將這620 份小麥種質(zhì)分為10 個類群；通過綜合評價，篩選出91 份較為優(yōu)異的種質(zhì)材料，可作為親本材料用于黃淮麥區(qū)小麥育種改良中。 近年來，分子標(biāo)記技術(shù)快速發(fā)展，因其具有多態(tài)性豐富、遺傳信息量大、不受外界環(huán)境條件影響等優(yōu)點(diǎn)而在小麥遺傳多樣性研究中得到較為廣泛的應(yīng)用[9]。 例如盧麗斌等[10]利用AFLP 技術(shù)對安徽省小麥赤霉病菌4 個地理群體的68 個供試菌株進(jìn)行了群體遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 個群體間的遺傳距離與地理分布沒有明顯的相關(guān)性，遺傳變異主要存在于群體內(nèi)，群體間的遺傳變異較小；韓芳等[11]采用SRAP 分子標(biāo)記對70 份黃淮麥區(qū)小麥品種的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)河南省小麥品種的多樣性指數(shù)最高，江蘇省小麥品種多樣性指數(shù)最低；羅琴等[12]利用42 條ISSR 引物對11 份人工合成小麥和3 個普通小麥材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)材料間的平均遺傳相似系數(shù)為0.790，表明這14 份小麥材料親緣關(guān)系較近。

SSR(simple sequence repeats)作為一種重要類型分子標(biāo)記，具有分布位點(diǎn)多、多態(tài)性豐富、易于操作、可覆蓋整個基因組等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于小麥遺傳多樣性研究中[13-14]。 趙檀等[15]利用覆蓋小麥全基因組的SSR 標(biāo)記對河北省1949 年至2012 年審定的169 份小麥品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果認(rèn)為，自1949 年以來，雖然品種的等位基因頻率在下降，但多樣性水平卻呈現(xiàn)上升趨勢；根據(jù)遺傳相似系數(shù)，供試品種可劃分為5 大類。

雖然前人利用分子標(biāo)記技術(shù)對小麥遺傳多樣性進(jìn)行了較多研究，但由于試驗(yàn)材料和研究方法不同，研究結(jié)果并不具有通用性，且許多研究還存在試驗(yàn)材料來源單一且只針對國內(nèi)小麥種質(zhì)的問題。 本試驗(yàn)以來自不同國家及我國不同區(qū)域的小麥品種(系)和地方農(nóng)家種等為材料，利用SSR 標(biāo)記對其遺傳多樣性進(jìn)行研究，以全面揭示這些材料間的遺傳差異及親緣關(guān)系，同時構(gòu)建每個小麥種質(zhì)的DNA 指紋圖譜，以期為小麥種質(zhì)資源保護(hù)及新品種培育提供有效材料支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料及田間種植

試驗(yàn)材料為來自國內(nèi)外的100 份小麥種質(zhì)(表1)，其中，國外種質(zhì)11 份，包括澳大利亞的4份，法國的4 份，保加利亞、羅馬尼亞和墨西哥的各1 份；國內(nèi)種質(zhì)89 份，包括河南的47 份，陜西的8 份，北京的6 份，江蘇的6 份，山東的6 份，河北的5 份，山西的3 份，四川的2 份，貴州的2 份，安徽的1 份，寧夏的1 份。

表1 本研究所用小麥種質(zhì)信息

表2 本研究所用SSR 引物的信息

2021 年10 月將這100 份小麥材料種植于河南省平頂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥基地。 每個材料設(shè)置3 個重復(fù)，每個重復(fù)種3 行，每行行長2 m，行距25 cm。 田間管理與普通大田相同。

1.2 基因組DNA 提取及PCR 擴(kuò)增

在小麥苗期采集葉片材料，用SDS 法提取小麥基因組DNA[16]，TE溶解后用SSR引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)總體積為15 μL，包括1 μL 基因組DNA、2 μL 上下游引物、5 μL 2×BlueTaqPCR Mix、7 μL ddH2O。 在Eppendorf PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行SSR-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下:94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，Tm 復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。SSR 引物一部分來自網(wǎng)站http:/ /wheat.pw.usda.gov/ggpages/DEM/ggtabledefs.html，另一部分來自文獻(xiàn)[17]，均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 電泳檢測及帶型統(tǒng)計(jì)

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，保存膠片并進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)，處于同一位點(diǎn)的有帶記為“1”、無帶記為“0”、缺失記為“9”，獲得由“0、1、9”組成的數(shù)據(jù)矩陣，用于下一步分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用軟件NTSYS 中的非加權(quán)平均法(UPMGA)計(jì)算小麥種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)，并對小麥種質(zhì)進(jìn)行聚類分析；統(tǒng)計(jì)分析不同引物的擴(kuò)增總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)、多態(tài)性條帶百分比，利用POPGEN 32 軟件估算SCoT 引物和ISSR 引物的遺傳參數(shù)，包括Nei’s 基因多樣性指數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon’s 信息指數(shù)等。

2 結(jié)果與分析

2.1 國內(nèi)外小麥種質(zhì)資源SSR 多態(tài)性分析

首先利用表型性狀差異較大的兩個小麥種質(zhì)對125 對SSR 引物進(jìn)行篩選，最終選擇條帶清晰、多態(tài)性豐富的23 對引物用于對100 份小麥種質(zhì)進(jìn)行檢測分析，示例如圖1，結(jié)果詳見表3。 23對SSR 引物對100 份小麥種質(zhì)擴(kuò)增共獲得235 個基因位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)232 個，占比達(dá)到98.72%。 每對SSR 引物檢測位點(diǎn)數(shù)介于6～18 之間，平均等位位點(diǎn)數(shù)為10.09 個；其中，Xcfa2153擴(kuò)增出的位點(diǎn)最多，為18 個，而SSR26 和Xgwm539 擴(kuò)增的位點(diǎn)最少，均只有6 個。 SSR 引物的多態(tài)性位點(diǎn)百分比表現(xiàn)較為突出，除Xwmc256、Xwmc335、Xgwm499 分別為87. 5%、88.9%、91.7%外，其余引物的多態(tài)性位點(diǎn)百分比均為100%，每對引物多態(tài)性位點(diǎn)百分比平均為98.61%。 有效等位基因數(shù)變幅為1.16 ～1.69，平均為1.35；Nei’s 基因多樣性指數(shù)分布在0.14 ～0.39之間，平均為0.22；Shannon’s 信息指數(shù)的變化范圍是0.26 ～0.58，平均值為0.36。 綜合來看，本研究選擇的SSR 引物在檢測小麥遺傳差異方面表現(xiàn)均較好。

圖1 SSR144 對部分小麥種質(zhì)的擴(kuò)增情況

表3 本研究所用SSR 標(biāo)記的遺傳多樣性參數(shù)

2.2 國內(nèi)外小麥種質(zhì)資源親緣關(guān)系分析

遺傳相似系數(shù)可以反映不同小麥種質(zhì)間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。 基于SSR 引物檢測到的不同小麥種質(zhì)基因型數(shù)據(jù)，獲得了100 份小麥種質(zhì)間的Nei’s 遺傳相似系數(shù)，變幅在0.56 ～0.96，平均為0.73，表明100 份小麥種質(zhì)存在較豐富的遺傳變異。 其中，來自甘肅的種質(zhì)09N37 與來自江蘇的種質(zhì)10EW137 之間的遺傳相似系數(shù)最小，說明這兩個種質(zhì)間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；而最大的遺傳相似系數(shù)來自于種質(zhì)洛麥21 號與偃展4110 之間，意味著兩者間的親緣關(guān)系最近，可能與它們均來自河南有關(guān)。 另外，超出平均遺傳相似系數(shù)的小麥種質(zhì)數(shù)占參試種質(zhì)總數(shù)的50.99%，而低于平均遺傳相似系數(shù)的小麥種質(zhì)占參試品種總數(shù)的48.98%。

2.3 國內(nèi)外小麥種質(zhì)資源聚類分析

利用SSR 檢測數(shù)據(jù)獲得小麥種質(zhì)間的遺傳距離，以此構(gòu)建100 份小麥種質(zhì)的遺傳聚類圖譜，見圖2。 可以看出，100 份小麥種質(zhì)可被劃分為6個類群，不同類群包含的小麥種質(zhì)數(shù)存在較大差異。 第Ⅰ類群包含3 個小麥種質(zhì)，即宿553、貴農(nóng)17 和開麥21；第Ⅱ類群包含的小麥種質(zhì)數(shù)最少，僅1 個，為來自河北的衡觀35；第Ⅲ類群包含2個小麥種質(zhì)，均來自國外，分別是來自澳大利亞的CD87 和來自法國的B08；第Ⅳ類群包括5 個小麥種質(zhì)，分別是西峰9 號、臨汾10 號、鄭麥004、西農(nóng)979 和04 中3804；第Ⅴ類群包含的小麥種質(zhì)較多，共有27 個，占參試種質(zhì)總數(shù)的27%，其中來自河南的小麥種質(zhì)較多，其數(shù)量達(dá)到該類群總數(shù)的51.9%；第Ⅵ類群包含的小麥種質(zhì)數(shù)最多，達(dá)到62個，占參試種質(zhì)總數(shù)的62%，其中來自河南的種質(zhì)占到46.8%。 另外發(fā)現(xiàn)，來自北京的5 個小麥種質(zhì)被聚在同一個類群，來自法國的法國麥、Belero 和B20 也被劃為一類，而且源自國外的小麥種質(zhì)也基本被劃分在同一類群。

圖2 100 份小麥種質(zhì)基于遺傳距離的聚類分析結(jié)果

2.4 國內(nèi)外小麥種質(zhì)資源DNA 指紋圖譜的構(gòu)建

為了更有效地保護(hù)和利用小麥種質(zhì)資源，從23 個SSR 引物中選取了多態(tài)性比較豐富的5 個SSR 引物，即Xwmc335、Xgwm294、Xcfd23、Xgwm499、Xwmc24，構(gòu)建了100 份小麥種質(zhì)的DNA指紋圖譜，該DNA 指紋圖譜共包括了47 個擴(kuò)增變異位點(diǎn)，詳見表4。 可以看出，每個小麥種質(zhì)擁有自己特有的DNA 指紋特征譜帶，這些譜帶可以作為“身份證”用于對小麥種質(zhì)進(jìn)行有效區(qū)分、保護(hù)和利用。

3 討論

隨著生活水平的不斷提高，人們對現(xiàn)代小麥生產(chǎn)提出了更高的要求，在保證高產(chǎn)的同時，優(yōu)質(zhì)、抗逆等特性也逐步成為育種專家追求的重要目標(biāo)，這就要求小麥育種實(shí)現(xiàn)新的突破。 為了實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)，除了利用先進(jìn)的育種技術(shù)外，豐富的種質(zhì)資源是重要的前提和基礎(chǔ)。 同時，隨著國內(nèi)外小麥種質(zhì)資源交流的日益頻繁，種質(zhì)資源利用過程中經(jīng)常會出現(xiàn)“異種同名”和“異名同種”等問題，影響了小麥種質(zhì)資源的保護(hù)和利用。 因此，開展小麥種質(zhì)資源研究已經(jīng)成為一項(xiàng)重要課題。

遺傳相似性系數(shù)可以直接反映不同小麥種質(zhì)間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，可為小麥種質(zhì)在下一步的遺傳研究及育種實(shí)踐中利用提供依據(jù)。 雖然前人已利用分子標(biāo)記對小麥種質(zhì)遺傳多樣性進(jìn)行了較多分析[18-22]，但由于研究材料和方法的不同，其遺傳多樣性程度差異較大，研究結(jié)果間的通用性較差，對其它研究參考價值有限。 如陳天青等[20]研究發(fā)現(xiàn)，貴州小麥育種核心種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)為0.13 ～0.63，平均為0.33；Masmoudi 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，突尼斯小麥種質(zhì)遺傳相似系數(shù)介于0.36 ～0.79 之間；徐志等[22]對四川小麥品種遺傳多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，品種間遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.62～1.00；而本研究對100 份國內(nèi)外小麥種質(zhì)的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，供試小麥種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)變幅為0.56～0.96，平均為0.73。

另外，前人研究多存在材料來源單一等問題，而本研究選用的100 份小麥種質(zhì)材料來源豐富，來自6 個國家，其中我國的小麥種質(zhì)來自12 個不同省份或地區(qū)。 但從本研究與前人研究的比較中也發(fā)現(xiàn)，小麥種質(zhì)遺傳多樣性水平與其來源地不存在必然的直接聯(lián)系，即來源越豐富其遺傳多樣性水平不一定越高。 該結(jié)論也得到了聚類分析結(jié)果的支持，即不同來源小麥種質(zhì)經(jīng)常被劃分在同一類群，而來自同一地區(qū)的小麥種質(zhì)也會被劃分在不同類群，這在一定程度上表明小麥種質(zhì)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近與其是否來自同一地區(qū)不存在必然的聯(lián)系。 這與喻俊杰[23]、李鮮花[24]等的研究結(jié)果存在一定的差異。

DNA 指紋圖譜可以為小麥種質(zhì)的科學(xué)保護(hù)和利用提供有效支撐，但前人開展該圖譜構(gòu)建的研究相對較少，如李紅琴等[25]利用SSR 標(biāo)記構(gòu)建了青海省審定小麥品種的分子身份證。 本研究利用變異位點(diǎn)豐富的5 個SSR 標(biāo)記構(gòu)建了100 份小麥種質(zhì)的DNA 指紋圖譜，且圖譜更加精細(xì)，更有利于對小麥種質(zhì)進(jìn)行區(qū)分和保護(hù)。 綜上，本研究結(jié)果可為供試小麥種質(zhì)深入研究及有效利用提供有用信息。

4 結(jié)論

本研究利用SSR 分子標(biāo)記分析了國內(nèi)外100份小麥種質(zhì)的遺傳多樣性。 選用的23 對SSR 引物在擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)百分比、有效等位基因數(shù)、Nei’s 基因多樣性指數(shù)和Shannon’s 信息指數(shù)等方面表現(xiàn)均較好。 這100 份小麥種質(zhì)中存在較豐富的遺傳變異，不同種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)變幅為0.56 ～0.96，平均為0.73，基于遺傳距離可將其劃分為6 個類群。 同時，利用多態(tài)性比較豐富的5 個SSR 引物，構(gòu)建了這100 份小麥種質(zhì)的DNA 指紋圖譜。 本研究結(jié)果可為供試小麥種質(zhì)的科學(xué)利用和保護(hù)提供一定依據(jù)。