CD4+CD25+CD127-調節性T細胞在老年慢性心力衰竭患者外周血中的表達水平及其預后評估價值▲

張雪飛 崔向輝 劉維潮 田 祥 耿 巍

(保定市第一中心醫院心內科,河北省保定市 071000)

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)多發于老年人群,部分患者經標準化治療后癥狀得以緩解,但仍有部分患者短期內出現心功能急劇下降,導致不良預后[1]。因此,尋求可預測老年CHF患者臨床轉歸的生物學標志物,并給予積極治療,對改善患者預后具有重要意義。血清N末端B型鈉尿肽前體(N-terminal pro-B-type natriuretic peptide,NT-proBNP)是目前常用于診斷CHF的標志物之一,與CHF病情程度及預后存在一定關系,但NT-proBNP容易受到患者年齡、體質指數等因素的影響,診斷特異度不高[2]。研究發現,免疫系統功能異常與CHF發生及發展密切相關[3]。調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)是具有免疫抑制功能的T淋巴細胞亞群,CD4+CD25+Treg是Treg主要類型之一,具有免疫抑制作用,可分泌調節性細胞因子抑制機體自身免疫細胞的活化[4]。CD127lowTreg是白細胞介素17的受體,具有介導淋巴細胞生存和發育的能力。研究發現,聯合檢測CD127lowTreg與CD4+CD25+Treg可更好地識別T淋巴細胞[5]。根據CD4+CD25+CD127-Treg的作用機制及CHF發病機制,我們推測外周血CD4+CD25+CD127-Treg可能參與CHF發生與發展。本研究觀察CD4+CD25+CD127-Treg在老年CHF患者中的表達情況,分析其預測CHF患者預后的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年4月至2020年4月我院心血管內科收治的93例老年CHF患者作為研究對象。納入標準:(1)CHF符合《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》[6]中的診斷標準,且經體格檢查、影像學檢查確診,部分懷疑為冠心病患者經冠狀動脈造影檢查確診;(2)年齡≥60歲;(3)患者均接受一般治療(飲食指導、運動指導)及藥物治療[利尿劑(托拉塞米)+血管緊張素轉換酶抑制劑(依那普利)+β受體阻滯劑(比索洛爾)+地高辛];(4)出院后完成為期1年的隨訪;(5)依從性好,精神正常。 排除標準:(1)合并肝功能損害者;(2)合并先天性心臟病者;(3)合并急性心肌炎、心內膜炎等其他心臟疾病者;(4)合并肺癌、肝癌等惡性腫瘤者;(5)伴自身免疫性疾病者;(6)近期使用影響免疫反應藥物者;(7)伴急慢性感染或炎癥性疾病者;(8)隨訪期間病死的患者;(9)既往行冠狀動脈旁路移植術或經皮冠狀動脈介入術者。其中,男性60例、女性33例,患者年齡60～75(66.6±2.2)歲,美國紐約心臟病學會(New York Heart Association,NYHA)[7]心功能分級為Ⅱ級48例、Ⅲ級31例、Ⅳ級14例,存在吸煙史23例。本研究經我院醫學倫理委員會審核批準(批準文號:20180220),所有患者均簽訂研究知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 收集一般資料: 收集患者入院時相關資料,主要包括性別、年齡、體質指數、病因(冠心病、高血壓病、心臟瓣膜病、風濕性心臟病)、NYHA心功能分級、合并基礎疾病(高血壓病、糖尿病、高脂血癥、冠心病、心臟瓣膜病、風濕性心臟病)情況、冠狀動脈病變程度、吸煙史(入院前平均吸煙≥1支/d,且持續時間超過6個月),以及入院時血清NT-proBNP水平、血小板計數、血紅蛋白水平、腎小球濾過率(glomerular filtration rate,GFR)、心功能指標[左室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)、左室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)]。

1.2.2 檢測相關實驗室指標:于入院后治療前檢測相關實驗室指標。(1)CD4+CD25+CD127-Treg表達水平。采集患者入院時清晨空腹肘靜脈血4 mL,置于含肝素的抗凝管內,于采集2 h內送檢,用于檢測外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平。取單克隆抗體CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE及同型對照抗體(對照為羊抗鼠IgGγ1γ2-FITC/PE單克隆抗體)各20 μL(eBioscience公司,批號分別為:20181112、20181026、20190123、20190105),加入100 μL外周血中,室溫下避光孵育15 min,再向試管中加入紅細胞裂解液500 μL,室溫下避光孵育10 min;加入PBS沖洗2次,使用TD-5M型離心機(濟南童鑫生物科技有限公司)以1 500 r/min離心5 min,離心半徑為10 cm;棄上清液后加入適量PBS,采用FACSCanto Ⅱ流式細胞儀(Becton,Dickinson and Company)以前向散射光和側向散射光設定淋巴細胞門,再以CD4側向散射光設定CD4+淋巴細胞門,檢測CD25+CD127-細胞群比例。(2)血清NT-proBNP水平。采集患者入院時清晨空腹肘靜脈血2 mL,以3 500 r/min離心15 min,取上清液,采用熒光免疫法檢測血清NT-proBNP水平,試劑盒購自A&D公司(批號:20180921)。(3)血小板計數、血紅蛋白水平、GFR。采集患者入院時清晨空腹肘靜脈血4 mL,其中2 mL用于檢測血小板計數、血紅蛋白水平,儀器為全自動血細胞分析儀(上海光電醫用電子儀器有限公司,型號:MEK-6410P)。取另外2 mL血樣本以3 500 r/min離心15 min,取上清液,采用酶法測定血清肌酐水平,試劑盒購自中山標佳生物科技有限公司(批號:20180928),計算GFR,男性GFR=(140-年齡)×體重(kg)×1.23/血清肌酐(μmol/L);女性GFR=(140-年齡)×體重(kg)×1.03/血清肌酐(μmol/L)。(4)心功能指標。采用IE33型超聲診斷儀[飛利浦超聲(上海)股份有限公司]測定患者LVEDD、LVEF。采用超聲心動圖取標準胸骨旁長軸切面,M型取樣線置于左室腱索水平測量LVEDD,同時運用平面Simpson法檢測患者LVEF。

1.2.3 隨訪。出院后采用電話及門診復查的方式進行隨訪,隨訪時間為1年。記錄患者隨訪1年內心血管不良事件發生情況。心血管不良事件主要包括心力衰竭惡化再次入院(患者因心力衰竭惡化再次住院接受治療)、惡性心律失常、非致死性心肌梗死,相關診斷標準參照《內科學》[8]。根據隨訪結果將患者分為預后不良組和預后良好組,其中,出現上述任一心血管不良事件者則納入預后不良組,均未出現上述心血管不良事件者則納入預后良好組。

1.3 統計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。符合正態的計量資料以(x±s)表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗;不符合正態分布的計量資料以[M(P25,P75)]表示,組間比采用Mann-WhitneyU檢驗;計數資料以例數(百分比)表示,組間比較采用χ2檢驗,若期望值<5,則采用連續校正卡方檢驗;等級資料的比較采用秩和檢驗;一般線性雙變量相關性分析采用Spearman直線相關檢驗;采用Logistic回歸模型分析患者預后不良的影響因素;繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平預測老年CHF患者預后的價值,其中曲線下面積(area under the cure,AUC)值>0.9表示預測性能較高,0.7～0.9表示有一定預測性能,0.5～<0.7表示預測性能較差。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 CHF患者的預后情況 93例患者隨訪期間共30例(32.3%)患者發生心血管不良事件,納入預后不良組,剩余63例(67.7%)患者納入預后良好組。

2.2 兩組患者觀察指標的比較 入院時,預后不良組患者血清NT-proBNP水平高于預后良好組,外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平低于預后良好組(P<0.05);兩組其他資料比較差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 兩組患者觀察指標的比較

2.3 老年CHF患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平與血清NT-proBNP水平的相關性 Spearman相關性檢驗結果顯示,老年CHF患者入院時外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平與血清NT-proBNP水平呈負相關(rs=-0.248,P=0.017)。

2.4 影響老年CHF患者預后不良的多因素分析 將老年CHF患者預后情況作為因變量(1=預后不良,0=預后良好),將血清NT-proBNP水平、外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平作為自變量(以實測值納入),進行Logistic回歸分析,結果顯示,入院時血清NT-proBNP過表達、外周血CD4+CD25+CD127-Treg低表達是老年CHF患者預后不良的危險因素(P<0.05),見表2。

表2 影響CHF患者預后不良的多因素分析

2.5 外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平預測老年CHF患者預后的價值 ROC曲線結果顯示,入院時外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平預測老年CHF患者預后的AUC為0.831(95%CI:0.745,0.917;P<0.001),有一定的預測價值,且當外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平截斷值取5.65%時,可獲得最佳預測價值,此時靈敏度為0.833,特異度為0.619,約登指數為0.486,見圖1。

圖1 外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平預測老年CHF患者預后的ROC曲線圖

3 討 論

CHF病因復雜,隨著病情加重,可導致患者出現心功能與腎功能衰竭,增加患者發生心血管不良事件的風險,導致患者預后不良[9]。蔣宏亮等[10]對189例老年CHF患者進行為期1年的隨訪發現,隨訪期間有60例患者發生心血管不良事件,預后不良發生率達31.7%。本研究93例老年CHF患者中有30例(32.3%)出現預后不良,與上述研究結果相似。因此,尋找可預測CHF患者出現預后不良的指標對于臨床治療具有重要的意義。

NT-proBNP主要由心室肌細胞合成及分泌,并經腎臟清除,主要反映心室壓力與容量負荷變化,是目前診斷CHF的主要血清學標志物[11-12]。當機體心室容量負荷升高后,心肌細胞合成釋放的NT-proBNP增加,血清NT-proBNP水平隨之升高[13]。研究證實,CHF患者血清NT-proBNP呈高表達,且NT-proBNP表達水平與患者病情程度呈正相關,NT-proBNP表達水平越高,患者心源性再住院率及病死率越高,預后越差[14]。但臨床研究發現,血清NT-proBNP水平易受患者年齡、性別、腎功能等影響,特異性欠理想,如與男性CHF患者相比,女性CHF患者血清NT-proBNP水平更高,體質指數低的CHF患者血清NT-proBNP水平明顯高于正常體質指數的患者,而超重或肥胖的CHF患者血清NT-proBNP水平低于正常體質指數的患者[15]。因此,急需尋找新型生物學指標單獨或聯合血清NT-proBNP水平預測CHF患者的病情及預后。

近年來有學者發現,免疫系統功能異常與CHF發生及發展存在一定聯系。Treg是具有免疫調節功能的T淋巴細胞,在免疫系統中發揮負向調節作用,可維持免疫耐受及抑制免疫反應[16-17]。研究發現,Treg缺乏可引起體內免疫狀態失衡,導致機體免疫細胞攻擊心肌細胞,加速心功能惡化[18]。CD4+CD25+Treg是具有獨特免疫調節功能的T淋巴細胞亞群,具有免疫抑制功能,可通過分泌細胞因子及作用于相關信號通路來發揮免疫調節功能,在機體免疫平衡中發揮重要作用[19]。胡澤平等[20]發現,CHF患者CD4+CD25+CD127-Treg表達水平降低,且與患者心功能惡化有關,推測CD4+CD25+CD127-Treg可能對CHF患者預后有一定影響。本研究結果顯示,預后不良組患者入院時血清NT-proBNP水平高于預后良好組,而入院時外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平低于預后良好組,且外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平與血清NT-proBNP水平呈負相關(P<0.05)。Logistic回歸分析結果顯示,外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平降低是老年CHF患者預后不良的危險因素,說明CD4+CD25+CD127-Treg低表達可能會導致老年CHF患者預后不良。分析原因可能是CD4+CD25+CD127-Treg低表達可引起患者免疫耐受功能受損,誘發針對自身抗原的病理性免疫應答,從而促進疾病的發展,導致患者預后不良。此外,CD4+CD25+CD127-Treg表達水平降低可導致患者機體免疫狀態失衡,引起炎癥介質大量釋放,且可在一定程度上加重心肌纖維化,增加心室重構風險,不利于患者預后[21]。為進一步分析外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平預測老年CHF患者預后的價值,本研究ROC曲線結果顯示,入院時外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平預測老年CHF患者預后的AUC為0.833,且當截斷值取5.65%時,可獲得最佳預測價值,臨床上可參考外周血CD4+CD25+CD127-Treg的表達情況來預測老年CHF患者的預后。但本研究也有局限性,如未觀察外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平聯合血清NT-proBNP水平預測老年CHF患者預后的價值,今后將進一步深入研究。

綜上所述,與預后良好的患者相比,預后不良的老年CHF患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平降低、血清NT-proBNP水平升高,外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平降低與老年CHF患者預后不良相關,推測外周血CD4+CD25+CD127-Treg表達水平在預測老年CHF患者預后中有一定的價值。