禽結核菌素生產用菌種的制備與鑒定

王楠，辛凌翔，徐磊，程君生，王團結，任小俠，毛開榮，李俊平

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

禽分枝桿菌(Mycobacteriumavium)是鳥分枝桿菌復合體(MAC)的一種，包括4個亞種，即禽分枝桿菌禽亞種(M.aviumsubsp.avium，MAA)、人豬型亞種(M.aviumsubsp.hominissuis，MAH)、森林土壤亞種(M.aviumsubsp.silvaticum，MAS)和副結核亞種(M.aviumsubsp.paratuberculosis，MAP)。這些亞種雖然密切相關，但每個亞種都具有不同的致病性、宿主范圍和環境分布[1-2]。

禽結核菌素純化蛋白衍生物(PPD)是用于禽結核菌素試驗的標準制劑，更重要的是禽類PPD也被用作牛皮內結核菌素比較試驗，用于感染牛分枝桿菌和其他分枝桿菌的區分[3]。不同的國家用于生產禽結核菌素的菌株各不相同，我國用CVCC68201、CVCC68202和CVCC68203株制備禽結核菌素，這3株菌1985年分離自結核病死雞。生產用種子和制備工藝應符合《中華人民共和國獸用生物制品規程》2000年版的有關規定[4]。本研究對生產禽結核菌素的種子進行了全面鑒定，并制備了提純禽結核菌素。

1 材料與方法

1.1 菌種

禽分枝桿菌CVCC68201、CVCC68202、CVCC68203,1985年9月1日凍干，由中國獸醫藥品監察所菌種保藏中心提供。

1.2 培養基及試劑

禽結核菌素國家標準品由中國獸醫藥品監察所菌種保藏中心提供。配氏培養基、蘇通培養基、普通肉湯，5%牛奶蔗糖溶液均購自北京中海生物科技有限公司，抗酸染色試劑盒和基因組提取試劑盒均購自索萊寶生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

SPF雞(2 kg左右)和SPF豚鼠(300～400 g)均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。本試驗經中國獸醫藥品監察所實驗動物福利與動物實驗倫理委員會審核通過。

1.4 菌種復壯

無菌打開菌種，用0.2 mL普通肉湯溶解，劃線接種2支/株配氏試管斜面。置37 ℃培養10 d以上。刮下、稱重、磨碎，加少量生理鹽水稀釋至10 mg/mL，每株菌靜脈注射SPF雞7只(0.2 mL/只)。接種后的15～40 d，無菌解剖SPF雞，取肝、脾、肺和腸系膜淋巴結，研磨后取上清液接種配氏培養基試管斜面各2支/株。復壯后分離的菌株凍干，按常規方法抽真空封口。

1.5 菌種鑒定

1.5.1 培養特性鑒定

取新批次凍干的菌種，無菌開啟安瓿瓶，加入0.2 mL普通肉湯溶解，接種2支/株配氏培養基試管斜面。置37 ℃培養10 d以上，觀察菌落形態。

1.5.2 形態和生化特性鑒定

按常規方法，挑取配氏培養基培養的單個結核菌落進行萋爾-尼爾遜(Z-N)抗酸染色，觀察細菌形態。

煙酸試驗：取培養物1支，加入15 mL熱蒸餾水，浸泡菌落30 min，將浸泡的菌懸液分裝入2支試管中，每管0.4 mL；每管加入3%聯苯胺乙醇溶液0.2 mL，取其中1管，加入0.2 mL 10%溴化氰水溶液，觀察試驗現象。

耐熱觸酶試驗：吸取0.5 mL 10 mg/mL的菌液于小試管內，在68 ℃水浴中孵育20 min，冷卻后加入0.5 mL H2O2和吐溫-80混合液(10%吐溫80加等體積30% H2O2)，觀察氣泡產生情況。

1.5.3 真空度、剩余水分和純粹檢驗

根據《中國獸藥典》2015年版三部[5]規定的方法進行各項檢驗。

1.5.4 PCR測定

用生理鹽水洗下固體培養基上生長良好的菌落，提取3株菌的全基因組DNA，以全基因組 DNA為模板，參考文獻[5]的方法設計dnaJ、IS900、IS1245和IS901 4對引物，參考文獻[6]優化的反應程序進行擴增。PCR反應結束后，取10 μL產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。禽分枝桿菌各亞種的多重PCR判定標準：多重PCR檢測的擴增條帶呈現3條目的條帶，即577 bp(IS901基因片段)、385 bp(IS1245基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)則判為禽分枝桿菌禽亞種/禽分枝桿菌森林土壤亞種；多重PCR檢測的擴增條帶呈現2條目的條帶，即385 bp(IS1245基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)條帶則判為禽分枝桿菌人豬亞種；多重PCR檢測的擴增條帶呈現2條目的條帶，即215(IS900基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)條帶則判為禽分枝桿菌副結核亞種。

表1 合成的引物序列

1.5.5 免疫原性測定

普通培養基液體表面生長良好的3株菌培養物，121 ℃高壓滅菌 30 min，用0.4 μm的網紗過濾，取濾出的上清液，加入40%三氯乙酸混合，使其終濃度為4%。4 ℃靜置，沉淀蛋白，5 000 r/min離心蛋白沉淀，用1 mol/L NaOH溶液溶解蛋白，調節pH=7.4，過濾除菌，即為禽結核菌素。

制備禽分枝桿菌致敏原，收集過濾后的菌膜，稱取7 g 于7 mL生理鹽水浸泡過夜，研碎，加入等體積的弗氏不完全佐劑，反復抽吸混勻，4 ℃冰箱保存備用。肌肉注射禽分枝桿菌致敏原0.5 mL/只，用Bradford法測定禽結核菌素和禽結核菌素國家標準品的蛋白含量，2種菌素稀釋成相同濃度的蛋白含量，再分別作1∶100稀釋后，與禽結核菌素國家標準品進行比對，皮內注射6只致敏合格的豚鼠，每種結核菌素各注射2個點，0.1 mL/點，注射后24 h用游標卡尺測量注射點的紅腫面積。新制備結核菌素的平均反應面積和標準菌素的平均反應面積的比值在0.9～1.1之間時，判定為符合規定[7]。

2 結果與分析

2.1 培養特性鑒定

禽分枝桿菌CVCC68201、CVCC68202株均從感染的SPF雞脾臟中分離，禽分枝桿菌CVCC68203株從肝臟中分離，上述菌株均常規凍干。復蘇凍干后的菌株，配氏培養基培養15 d后，肉眼均能觀察到禽分枝桿菌長出的菌落呈淡黃色、奶油狀(圖1)，菌落黏稠、扁平、薄，挑取菌落時可成拉絲狀。

圖1 CVCC68201(左)、CVCC68202(中)、CVCC68203(右)生長狀態

2.2 形態和生化特性鑒定

挑取單個結核菌落，在載玻片上進行萋爾-尼爾遜(Z-N)抗酸染色，染色結果均為抗酸染色陽性，圖2為CVCC68201的抗酸染色結果，菌體為細短、直或稍彎的小桿菌。煙酸試驗結果為產生無色沉淀，未見桃紅色沉淀，煙酸試驗陰性；耐熱觸酶試驗結果無氣泡產生，耐熱觸酶試驗為陰性。

圖2 CVCC68201抗酸染色結果(1 000×)

2.3 真空度、剩余水分和純粹檢驗

凍干的 3 株菌種剩余水分測定結果均小于4%，符合規定。真空度測定結果均呈現白色、粉色或紫色輝光，將不符合規定的凍干菌種進行無害化處理。分別各抽取5支真空度測定良好的3株菌種，用配氏培養基進行純粹檢驗，結果均為純粹生長(5/5)。

2.4 PCR測定

由圖3看出，3株菌均能擴增出577 bp(IS901基因片段)、385 bp(IS1245基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)的條帶，結果表明均為禽亞種/森林土壤亞種。

M. CVCC68201；1. CVCC68201；2. CVCC68202；3. CVCC68203

2.5 免疫原性測定

用Bradford法測定禽結核菌素國家標準品(2001)和新制備結核菌素的蛋白濃度，結果標準品的濃度為3.6 mg/mL，新制備結核菌素的濃度為5.1 mg/mL。將標準品和新制備結核菌素均稀釋成1.8 mg/mL后，分別作1∶100稀釋，對致敏合格的6只豚鼠皮內注射，0.1 mL/只。注射結核菌素24 h后，測量標準菌素和新制備菌素接種豚鼠的皮膚紅腫面積，結果見圖4。

圖4 標準菌素(C)與新制備菌素(T)注射豚鼠后的皮膚紅腫情況

計算平均反應面積比值，結果見表2。新制備菌素與標準菌素的皮膚變態平均反應面積比值為1.07，此結果符合質量標準規定。

表2 標準菌素和新制備菌素注射豚鼠的皮膚紅腫面積

3 討論

禽分枝桿菌被認為是“非典型分枝桿菌”，與結核分枝桿菌不同，禽分枝桿菌是需氧、無運動性的桿狀細菌，其長度在1～3 μm之間[8]。通過抗酸(Z-N)染色法可特異性著色。禽分枝桿菌可以在土壤中生存長達4年，對環境有很強的抵抗力[9-10]。與結核分枝桿菌和牛分枝桿菌相比，禽分枝桿菌最適生長溫度為25～45 ℃。初代分離時，含有5%～10%的CO2和全卵或蛋黃的培養基可促進其生長[4，10]。通常，禽分枝桿菌在培養后2～4周內產生“平滑”菌落，如果培養基中含有甘油，菌落會更大。光滑透明的菌落對雞有較強毒力，而具有光滑圓頂或粗糙菌落則無毒力[11]。本文中分離和鑒定的禽分枝桿菌在含有蛋黃的配氏固體培養基，以及含有大量甘油的液體蘇通培養基中均生長良好，固體培養為光滑透明的菌落，提示對雞有較強的毒力，而且在SPF雞體內復壯時也發現了典型病變，液體培養后提純的禽結核菌素在致敏的豚鼠表現出良好的免疫原性。

禽結核病是一種傳染性疾病，可以感染包括人在內的多種動物，家禽的結核病主要表現為腸道和肝臟疾病，也可擴散到肺和脾臟等器官[7，9-12]。禽結核病潛伏期長，病程長，癥狀可持續數周或數月。它在幼禽中的流行率較低，與成年禽相比，病變也較輕，蛋雞感染禽結核病機會較大，損失也較嚴重。禽分枝桿菌感染的診斷基于臨床癥狀、剖檢病變，病理切片和病變組織的抗酸染色。活禽的出口貿易中，常通過皮內接種禽結核菌素進行檢疫[4]。陽性反應被確定為接種部位出現熱性腫脹或直徑約5 mm的小結節。結核菌素試驗診斷鳥類感染禽分枝桿菌相對于臨床病變診斷法的準確率大約為80%，但在感染的晚期，鳥類可能沒有反應[10，13]。

自1952年世界衛生組織(WHO)公布第一批結核菌素國際標準以來[14]，結核菌素為迄今為止診斷結核病感染的最重要診斷試劑。由于禽分枝桿菌廣泛分布于環境中，尤其是地表水、土壤和污染的飼料中。張建東等[15]對我國牛場中禽分枝桿菌的流行情況進行調查，檢測到禽分枝桿菌陽性率是34.9%，說明我國牛場普遍存在禽分枝桿菌感染。

世界動物衛生組織(WOAH)推薦的國際貿易中牛結核病的檢疫方法是結核菌素皮膚試驗(TST)。TST是診斷結核病感染最常用的方法之一，尤其在發展中國家，因為其成本相對較低，易于應用，且對基礎設施的要求也低。TST方法包括皮內注射牛結核菌素純化蛋白衍生物(PPD)，然后在72 h后測量注射部位的腫脹(遲發性超敏反應)。TST可以單獨使用牛結核菌素進行試驗，也可以使用禽結核菌素和牛結核菌素進行比較試驗。在皮內比較試驗的解釋中，如果牛結核菌素注射部位的牛皮膚厚度增加比注射禽結核菌素的部位不低于4 mm，則通常認為TST反應陽性；如果牛結核菌素注射部位的牛皮膚厚度增加大于禽類注射部位結核菌素，且差值小于4 mm，則認為TST反應不確定；如果牛結核菌素注射部位皮膚厚度的增加小于或等于禽結核菌素注射部位，則認為TST反應陰性[4，15]。

應用本文中鑒定的3株禽分枝桿菌制備禽結核菌素，目的在于區分動物感染的分枝桿菌的種屬是牛分枝桿菌還是禽分枝桿菌，對于落實人畜共患的結核病防控具有非常重要的意義。