姜黃素抑制脊髓組蛋白甲基化在大鼠急性疼痛中的作用

王存斌

（天津市北辰醫院麻醉科，天津 300400）

術后急性疼痛（Acute post surgery pain，APSP）主要是患者受到外源性手術刺激后所產生的一系列生理、心理等應激反應。APSP一般發生在術后的24～72 h之內，會增加患者機體疼痛負擔，不利于機體的康復[1]。組蛋白是真核生物染色體的基本結構單位，組蛋白包括H1、H2A、H2B、H3、H4五種類型，組蛋白H3K9甲基化是指組蛋白H3第九位賴氨酸殘基在組蛋白甲基轉移酶的催化下發生了甲基化修飾[2]。研究發現HAT抑制劑ACA可降低小鼠切口痛模型脊髓組蛋白H3K9的表達[3]。神經病理性疼痛大鼠組蛋白H3K9甲基化表達增加[4]，姜黃素對神經系統的生理功能和病理生理過程有諸多影響，可減輕神經炎癥反應，抑制慢性疼痛的外周或中樞敏化[5]，還可減輕大鼠的手術后疼痛，促進手術創傷的恢復[6]，但具體機制尚不明確。本研究擬評價姜黃素對大鼠急性切口痛及脊髓組蛋白甲基化的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成年雄性清潔級Wistar大鼠，體重200～250 g，周齡6～8 w，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（軍）-2012-0004。采用隨機數字表法將成功鞘內置管的48只健康雄性Wistar大鼠分成4組（n=12）：對照組（D組），疼痛模型組（I組），姜黃素組（C組），二甲基亞砜組（DMSO組）

1.2 方法

1.2.1 鞘內置管[7]

Wistar大鼠經腹腔注射10%戊巴比妥3 mL·kg-1麻醉后，取俯臥位于后正中L5-6間隙作長約3 cm的縱行切口，逐層分離筋膜、肌肉，切斷L5-6的棘間韌帶，充分暴露L5-6間隙。大鼠脊柱向前彎曲，提起L5椎板，針頭刺破黃韌帶和硬膜，經破口置入PE0503導管，向上置入2 cm，有腦脊液流出，大鼠出現甩尾反射即為置管成功。導管另一端經皮下隧道引出于頭頸部，外露3 cm固定，火燒密封導管頭部，避免腦脊液流出。

1.2.2 切口痛大鼠模型[8]

參照Brennan[8]等方法制備切口痛大鼠模型。大鼠在異氟醚麻醉后，取俯臥位，固定大鼠，取其左后足趾部，消毒、鋪巾，從后跟0.5 cm處向前做一長約1 cm的縱行切口，動作盡量輕柔保持肌腱及神經不被離斷，輕壓傷口止血后撒上抗生素，縫合切口。術畢大鼠均采用單籠飼養，注意保溫，觀察大鼠情況。

1.2.3 分組給藥

D組不做任何操作，行為學測試前30 min通過鞘內置管單次注射生理鹽水10 μL；I組切口痛建模前30 min通過鞘內置管單次注射生理鹽水10 μL ；C組切口痛建模前30 min通過鞘內置管單次注射姜黃素（批號：31027-02-3，Alexis公司，美國）10 μL（50 μg·μL-1）；DMSO組切口痛建模前30 min通過鞘內置管單次注射10%二甲基亞砜（批號：58-59-4，上海免基實業有限公司）10 μL。

1.3 大鼠的機械性痛閾（Mechanical paw withdrawal threshold，MWT）及熱痛閾（Thermal paw withdrawal latency，TWL）

分別于建模前24 h（T0），切口痛建模后1 h（T1）、3 h（T2）、6 h（T3）時，測定大鼠的機械性痛閾（MWT）和熱痛閾（TWL）。將大鼠放入固定器內，左足趾放置于YSL-3E型電子壓痛儀（濟南益延科技發展有限公司）的尖形壓頭下施壓，當大鼠出現嘶鳴或掙扎時停止施壓，記錄壓力，測定3次，間隔15 min，取平均值即為MWT。將大鼠放在YSL-6B型智能熱板儀（濟南益延科技發展有限公司）的玻璃罩內，溫度設定為55℃，記錄大鼠左足出現舔足或逃避動作的時間，測定3次，間隔15 min，取平均值即為TWL。為避免大鼠燙傷，TWL的測定時間不超過30 s。

1.4 免疫組化法檢測甲基化H3K9表達水平

分別于T1、T3時點疼痛行為學測量后，取6只大鼠，在異氟醚麻醉下取出其L4-5節段脊髓，采用免疫組化法檢測甲基化H3K9表達水平。脊髓組織放入4%甲醛中固定24 h，常規脫水、透明、包埋，切片，脫蠟，山羊血清封閉，滴加甲基化H3K9抗體（Cell Signaling Technology公司，美國），4℃孵育24 h；滴加辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG二抗（北京中杉金橋生物公司），37℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復染細胞核，光鏡下進行觀察，細胞核呈棕黃色為陽性細胞，應用Image-Pro Plus圖像分析系統測定光密度值，反映甲基化H3K9表達水平。

1.5 統計學處理

采用SPSS17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±SD）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般行為學的改變

建模前各組大鼠活動狀態良好，建模后各組大鼠狀態良好，傷口未裂開、未感染。但I組和DMSO組活動顯著減少。

2.2 四組大鼠整體MWT的比較

與D組比較，C組、I組和DMSO組T0時點比較無統計學差異（P＞0.05），T1-3時點MWT降低（P＜0.05）；與I組比較，T1-3時點DMSO組MWT指標無統計學差異（P＞0.05），T1-3時點C組MWT升高（P＜0.05），見表1。

表1 四組大鼠各時點MWT整體比較（±SD，n=12）

表1 四組大鼠各時點MWT整體比較（±SD，n=12）

注：與D組比較，aP＜0.05；與I組比較，bP＜0.05。

MWT(pa)組別 T0 T1 T2 T3 D組 201.8±5.37 203.8±3.36 203.9±3.31 204.3±3.24 I組 203.2±4.17 32.92±1.37 a 31.73±1.71 a 31.93±2.29 a C組 202.5±3.88 52.84±2.90 a b 57.12±2.81 a b 54.30±2.19 a b DMSO組 202.6±6.63 32.38±1.67 a 32.07±1.80 a 32.37±2.71 a

2.3 四組大鼠整體TWL的比較

與D組比較，C組、I組和DMSO組T0時點比較無統計學差異（P＞0.05），T1-3時點TWL縮短（P＜0.05）；與I組比較，T1-3時點DMSO組MWL指標無統計學差異（P＞0.05），T1-3時點C組TWL延長（P＜0.05），見表2。

表2 四組大鼠各時點TWL整體比較（±SD，n=12）

表2 四組大鼠各時點TWL整體比較（±SD，n=12）

注：與D組比較，aP＜0.05；與I組比較，bP＜0.05。

TWL(s)組別 T0 T1 T2 T3 D組 5.42±0.305 5.335±0.204 5.258±0.220 5.248±0.176 I組 5.341±0.243 2.032±0.154 a 2.008±0.099 a 2.067±0.096 a C組 5.276±0.270 3.095±0.133 a b 3.027±0.118 a b 3.142±0.109 a b DMSO組 5.376±0.195 2.064±0.141 a 2.088±0.146 a 2.087±0.125 a

2.4 病理學的變化

各組間比較大鼠脊髓均無炎性細胞的浸潤，脊髓細胞未發現水腫、壞死，組織細胞機構與形態正常，見圖1。

2.5 組蛋白H3K9甲基化表達的變化

與D組比較，I組、C組和DMSO組T1和T3時點脊髓甲基化H3K9表達上調（P＜0.05）；與I組比較，C組T1和T3時點脊髓甲基化H3K9表達下調（P＜0.05），DMSO組指標無統計學差異（P＞0.05），見表3，圖2。

表3 組蛋白H3K9甲基化表達的比較（±SD，n=6）

表3 組蛋白H3K9甲基化表達的比較（±SD，n=6）

注：與D組比較，aP＜0.05；與I組比較，bP＜0.05。

組別 H3K9甲基化表達T1 T3 D組 0.304±0.013 0.303±0.012 I組 0.649±0.025a 0.652±0.024a C組 0.406±0.019ab 0.406±0.014ab DMSO組 0.648±0.024 0.651±0.025

3 討論

姜黃素是姜科植物姜黃中最重要的有效成分，通過多種作用機制發揮鎮痛作用，緩解不同類型的疼痛，改善患者預后[9,10]。關于姜黃素在鎮痛方面的研究主要以背根神經節、脊髓背角、相關炎癥因子以及酶活性為主[11,12]，研究顯示大鼠模型對應的熱痛敏以及機械性痛敏明顯減輕，這種鎮痛作用與對脊髓被根神經節中相關物質的抑制有關，如p-CREB、p-ERK以及c-fos等[13,14]。此外，脊髓背角以及脊髓被根神經節中kBp65受到抑制以及CX3C含量的下降也是神經病理性疼痛減輕的主要機制，這也是姜黃素用于神經病理性疼痛的重要作用機理[15]。研究指出，通過鞘內注射姜黃素可以將脊髓TOLL樣受體4、白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子α水平降低，而對應的脊髓IL-10含量水平則會明顯提升，通過這一作用機制減輕了大鼠模型對應的疼痛感，也就是說姜黃素在發揮鎮痛期間過程中與脊髓TOLL樣受體4信號通路以及促炎性因子的調節作用有關[16,17]。

神經病理性疼痛作為一類慢性疼痛疾病，患者血清中的皮質醇濃度存在異常，采用姜黃素治療后可以降低血清中的皮質醇濃度，使其逐漸恢復到正常水平，并對背根神經節、脊髓背角等11-β羥基固醇脫氫酶活性產生抑制，使得患者在臨床上疼痛程度降低[18]。在建立大鼠模型后，通過使用姜黃素進行治療，模型大鼠的痛敏改善明顯，這與脊髓背角神經元細胞凋亡減少有著密切關系[19]。當前關于姜黃素在鎮痛方面的研究主要以背根神經節、脊髓背角、相關炎癥因子以及酶活性為主，在不同作用機理方面也都進行了相關的研究，不過目前尚無達成共識，并且目前研究方向多以病理性疼痛為主，而對急性疼痛報道比較少。

本實驗中，與對照組比較，切口痛組、姜黃素組及DMSO組機械性痛及熱痛閾值均顯著下降，而與切口痛組和DMSO組比較，姜黃素組機械性痛及熱痛閾值有所上升，提示姜黃素對急性切口痛大鼠的急性痛有鎮痛作用；與對照組比較，切口痛組、姜黃素組及DMSO組組蛋白H3K9甲基化表達水平均顯著上升，而與切口痛組和DMSO組比較，姜黃素組組蛋白H3K9甲基化表達水平有所下降，提示姜黃素對急性切口痛大鼠的鎮痛作用可能與抑制組蛋白H3K9甲基化表達有關。

綜上所述，姜黃素可以減輕大鼠的急性疼痛，并降低了脊髓組蛋白甲基化水平的表達。