基于牛支原體P48蛋白間接ELISA檢測方法的建立

陳志遠，李樹凡，遲麗麗，于澤海，劉健，張玫瑜，徐守振

(青島農業大學動物醫學院，山東 青島 266109)

牛支原體(Mycoplasmabovis)是柔膜體綱、支原體屬中的一員，是引起牛病的一種重要的致病性病原體，在1961年被鑒定為致乳腺炎的病原，1976年被描述為呼吸道疾病的病因并命名為牛支原體[1]。現在證實牛支原體還可以導致牛的關節炎、流產、生殖道炎癥等多種疾病[2]。牛群運輸、飼養管理、環境變化等都可能引起牛支原體的流行，給養殖業帶來巨大危害。近年來隨著養牛業的不斷發展，養殖規模的不斷擴大，牛支原體感染已呈世界性分布，日本、歐洲、美國都暴發過牛支原體肺炎，造成了巨大的經濟損失[3-4]。2008年，我國首次出現了支原體引起的牛壞死性肺炎疫情[5]。2010年湖北省從外地引進的肉牛出現了以壞死性肺炎為主要特征的呼吸道傳染病并在全省快速傳播[6]，在中國十多個省份報道了牛支原體肺炎病例，危害十分嚴重，造成的經濟損失巨大[7]。牛支原體引起的疾病嚴重阻礙了我國養牛業的健康發展。因此，深入對支原體蛋白的研究，建立準確而快速的牛支原體抗體檢測方法是十分必要的。

由于支原體缺乏細胞壁，所以支原體細胞膜表面的膜蛋白在侵襲過程中起著非常重要的作用。目前認為，牛支原體主要通過膜蛋白纖毛，促進炎性因子的分泌、激活炎癥信號通路等方式干擾宿主細胞膜表面受體的功能，導致宿主細胞膜損傷甚至引起細胞凋亡[8]。P48蛋白廣泛存在于支原體表面，影響宿主細胞的黏附作用，與致病機理密切相關。支原體P48蛋白與其他膜蛋白相比，不同菌株間的基因序列同源性極高，具有保守性高的優勢[9]，可用作牛支原體診斷的靶標抗原，適用于診斷試劑的開發[10]。由于支原體的特殊結構，普通的藥物治療效果不顯著且沒有成熟的商品化疫苗[11]。病原的分離周期長，營養要求高，需要專業人員和儀器設備，因而無法適應牧場大量牛群篩選工作。ELISA有著高通量、操作簡單快捷、靈敏性及特異性好等優點，被廣泛應用于牧場檢測和篩查牛支原體。目前，用P48全蛋白建立抗體ELISA檢測方法未見報道。因此，本研究選取P48全蛋白進行可溶性表達、純化和Western blot鑒定，建立牛支原體抗體間接ELISA檢測方法，對該病的診斷、抗體水平的評估和防控措施的制定都具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

牛支原體抗體陰、陽性血清，牛巴氏桿菌抗體陽性血清，牛曼氏桿菌抗體陽性血清，牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)抗體陽性血清，牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)抗體陽性血清，牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)抗體陽性血清，牛結核病(MAP)抗體陽性血清均由青島農業大學獸醫微生物學實驗室保存，臨床血清收集自山東地區規模化奶牛場。

1.2 主要試劑和儀器

重組質粒pCold-P48由實驗室前期構建，His蛋白純化試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；馬血清購自Biosharp公司；酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、兔抗牛HRP標記抗體、TMB單組份顯色液購自Solarbio公司；牛支原體ELISA抗體檢測試劑盒購于國生生物；蛋白電泳儀、凝膠成像儀購自Bio-Rad公司；超聲波細胞粉碎機購自寧波新芝股份生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 P48蛋白原核表達及純化

重組質粒轉化BL21(DE3)感受態細胞，培養至菌液OD600為0.5～0.8時，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，16 ℃、220 r/min培養12 h，離心收集菌體沉淀，蛋白超聲破碎后，分別取上清液和沉淀進行SDS-PAGE，檢測蛋白是否可溶性表達。按照蛋白純化試劑盒說明書進行重組蛋白純化。

1.3.2 表達產物Western blot鑒定

采用濕轉法進行Western blot鑒定，100 V恒壓轉膜100 min；5% BSA封閉液室溫封閉1 h；1∶2 000稀釋鼠源抗His標簽一抗，4 ℃孵育過夜；1∶2 000稀釋兔抗鼠HRP標記抗體，室溫孵育1 h；按照碧云天BeyoECL Plus試劑盒說明進行顯色。

1.3.3 間接ELISA檢測方法建立

對純化后的P48蛋白，以間接ELISA方法為基礎，采用單因素變量的試驗方式，分別對影響間接ELISA反應的抗原包被濃度、最佳封閉液、一抗稀釋度、二抗稀釋度、抗原包被時間、封閉時間、一抗孵育時間、二抗孵育時間、顯色時間等因素進行方陣優化，每孔做3次平行重復，并計算變異系數，以評估本方法的重復性。

1.3.4 間接ELISA方法陰陽性臨界值確定

1.3.5 特異性試驗

使用優化后的ELISA方法對牛支原體抗體陰、陽性血清，IBRV，BVDV，MAP，BRSV，牛巴氏桿菌，牛曼氏桿菌抗體陽性血清進行同步檢測，以評估本ELISA方法的特異性。每孔做3次重復，并計算變異系數。

1.3.6 敏感性試驗

將牛支原體抗體陽性血清倍比稀釋至1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120、1∶10 240，使用優化后的ELISA方法進行檢測，以評估本ELISA方法的敏感性。每孔做3次重復，并計算變異系數。

1.3.7 重復性試驗

使用不同批次的蛋白包被酶標板，選取4份支原體陰性牛血清和4份牛支原體陽性牛血清進行檢測，每個血清做6個重復。使用同一批次的P48蛋白包被，對8份牛血清進行檢測，每個血清做6個重復，檢測結果分別計算變異系數，判定其重復性。

1.3.8 臨床樣品檢測

應用建立的ELISA方法與商品化牛支原體抗體ELISA檢測試劑盒同時檢測90份臨床牛血清樣品，比較檢測結果，計算陰陽性符合率。

2 結果與分析

2.1 重組P48蛋白表達及鑒定

SDS-PAGE結果顯示，超聲破碎后分離上清液成功表達P48蛋白，大小為103 kDa，與預期大小相符(見圖1)，純化后的蛋白與目的蛋白大小一致。Western blot鑒定結果顯示，純化后的重組P48蛋白在103 kDa處出現了特異性條帶，目的蛋白大小與預期大小相符，說明表達的蛋白為目的蛋白(見圖2)。

M. 蛋白質分子質量標準；1. 誘導后沉淀；2.誘導后上清液；3. 對照菌液。圖1 P48蛋白的誘導表達分析

M. 蛋白質分子質量標準；1. 未誘導對照；2. 重組P48蛋白；3. 空載體。圖2 重組蛋白的Western blot鑒定

2.2 間接ELISA方陣優化

2.2.1 最佳抗原包被濃度的確定

結果顯示，抗原包被濃度為5 μg/mL時，P/N比值最高，確定為最佳的抗原包被濃度，各包被濃度OD值見表1。

表1 抗原包被濃度優化

2.2.2 最佳封閉液的確定

結果顯示，當封閉液為10%馬血清時，陰陽性P/N值最高，確定為最佳的封閉液，各封閉液OD值見表2。

表2 最佳封閉液選擇

2.2.3 一抗最佳稀釋度的確定

結果顯示，當一抗稀釋度為1∶160時，P/N值最高，確定為最佳一抗稀釋度，各一抗稀釋度OD值見表3。

表3 一抗稀釋度優化

2.2.4 二抗最佳稀釋度的確定

結果顯示，當酶標二抗稀釋度為1∶12 000時，P/N值最高，確定為最佳二抗稀釋度，各二抗稀釋度OD值(見表4)。

表4 二抗稀釋度優化

2.2.5 最佳包被溫度、時間、封閉時間的確定

結果顯示，當包被溫度為4 ℃，包被時間為過夜，封閉時間為2 h時，P/N值最高，確定為最佳包被和封閉條件，各條件的OD值見表5。

表5 包被溫度、時間、封閉時間優化

2.2.6 一抗孵育時間及顯色時間

結果顯示，當一抗孵育時間為1 h，顯色時間為20 min時，P/N值最高，確定為最佳一抗孵育時間和顯色時間，各條件的OD值見表6。

表6 一抗孵育時間及顯色時間優化

2.2.7 酶標二抗孵育時間的優化

結果顯示，當酶標二抗孵育時間為30 min時，P/N值最高，確定為最佳二抗孵育時間，酶標二抗孵育時間的OD值見表7。

表7 二抗孵育時間優化

經過方陣優化后最佳條件為：5 μg/mL抗原包被后4 ℃過夜，10%馬血清封閉時間2 h，1∶160稀釋一抗孵育1 h，1∶12 000稀釋二抗孵育30 min，顯色20 min。

2.3 間接ELISA方法陰陽性臨界值確定

表8 陰陽性臨界值的確定

2.4 特異性試驗

特異性試驗結果顯示，僅牛支原體抗體陽性血清檢測OD450值大于0.361，其他血清均為陰性(表9)，表明該方法具有良好的特異性。

表9 特異性試驗結果

2.5 敏感性試驗

敏感性試驗結果顯示，當陽性血清稀釋2 560倍時，OD450值仍大于0.361(表10)，表明本方法具有良好的敏感性。

表10 敏感性試驗結果

2.6 重復性試驗

使用優化后的ELISA條件，檢測血清樣品，檢測結果顯示，批間重復試驗和批內重復性試驗的變異系數均小于15%(表11、表12)，表明該方法具有良好的重復性。

表11 批間重復性試驗

表12 批內重復性試驗

2.7 臨床樣品檢測

使用建立的間接ELISA方法與商品化牛支原體ELISA抗體檢測試劑盒同時檢測90份臨床牛血清樣品，并對檢測結果進行統計分析(表13)。牛支原體檢測試劑盒檢測結果：陽性樣品27份，陰性樣品63份。建立的間接ELISA檢測方法檢測27份陽性樣品結果為24份陽性，3份陰性；63份陰性樣品中，58份陰性5份陽性；兩者陽性符合率為88.89%，陰性符合率為92.06%，總體符合率為91.11%。

表13 臨床樣品檢測結果

3 討論

牛支原體相關疾病已成為危害養牛業的重要疾病之一，我國多個地區發生過牛支原體感染，造成了嚴重的經濟損失。目前，牛支原體的診斷包括病原分離鑒定、分子生物學、血清學診斷等[12]，牛支原體生長緩慢，診斷周期長，對病料的采集、運輸、試驗設備要求較高，臨床診斷較為困難。對牛群進行支原體抗體篩查可追蹤牛群近期感染情況，有利于判定牛群的感染狀態。牛支原體抗體檢測有多種方法，特異性抗體的血清學檢測被認為是篩選牛群的常用方法[13]，由于間接ELISA方法對儀器、環境要求不高，敏感性好，成本較低，檢測迅速，因此得到了廣泛認可，在對臨床血清、乳樣的大規模抗體檢測上具有廣闊的前景。目前，已經建立了P28[14]、P81[15]等牛支原體蛋白抗體檢測方法，因為各個蛋白的功能不同，因此選擇優勢蛋白進行表達十分重要[16]。P48蛋白具有良好的抗原性，穩定性高、特異性強，在支原體的生存中占據重要地位[17]。本研究將P48全蛋白進行可溶性表達，建立的間接ELISA方法敏感性高，特異性和重復性好。馬海彬等[18]用表達的支原體P48截短片段建立了間接ELISA方法，但未進行敏感性試驗。劉洋等[14]用支原體P28蛋白建立的ELISA方法檢測16份陽性血清，稀釋到1 028倍時出現陰性結果。本試驗建立的ELISA與基于P28[14]、P81[15]建立的ELISA相比，包被用抗原蛋白更少，被檢血清稀釋倍數更高，陽性血清稀釋到2 540倍時仍出現陽性結果，敏感性更高。對影響結果的各項因素進行優化，盡量減少試驗過程中抗體的交叉反應和非特異吸附[19]，節約了試劑，降低了試驗成本，使反應達到最佳效果。此外，表達的P48蛋白也可以和牛支原體乳樣相結合，可用來檢測乳樣中牛支原體抗體水平。

綜上，本研究建立的ELISA方法能夠正確區分牛支原體陰性、陽性血清，未與呼吸道常見細菌、病毒陽性血清發生反應，具有良好的特異性。與商品化牛支原體ELISA抗體檢測試劑盒相比，陽性符合率為88.89%，陰性符合率為92.06%，總體符合率為91.11%，說明本研究建立了一種符合率好、敏感性高的牛支原體間接ELISA檢測方法。本方法也可用于乳樣中牛支原體抗體水平的評估，具有廣闊的應用前景，對牛群的全群檢疫、抗體水平及支原體感染情況的評估都具有重大意義。