2014—2022年寧夏不同地區奶牛艾美耳球蟲病流行病學調查

黎玉瓊，于有利*，從志鵬，郭亞男，薛峰

(1. 寧夏農林科學院動物科學研究所，寧夏 銀川 750002；2. 西北農林科技大學動物醫學院，陜西 楊凌 712100；3. 南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095)

牛球蟲病是一種由艾美耳屬原蟲引起的全球性疾病，給全球諸多國家的農場社區和畜牧業生產造成了巨大的經濟損失。牛球蟲病在許多國家被認為是一種常見病，可流行于不同階段的牛群中，但在臨床上主要影響1歲以內的小牛。該病主要是由于在短時間內攝入大量卵囊引起的，當機體抵抗力低下時更容易發生。初乳缺乏、放養密度高、營養不良等原因被認為是牛球蟲病重要的誘發因素[1-4]。

艾美耳球蟲是頂復動物亞門的專性細胞內寄生蟲，主要侵襲腸上皮細胞并在其中繁殖。艾美耳球蟲生命周期由內生的無性繁殖和有性發育組成[5]。無性繁殖是通過裂殖體產生裂殖子進行傳代，寄生的細胞最后破裂并釋放出細長的裂殖體，入侵周圍的大腸黏膜細胞，在黏膜細胞中又分裂為更小的第二代裂殖體，隨后是有性繁殖，第二代裂殖體又分裂為成熟雄配子母細胞和成熟雌配子母細胞。每個母細胞產生大約100個有活力的配子，從而形成合子。合子被包裹在保護壁中，形成了從宿主釋放到外部環境中的卵囊[5]。寄生于牛體的各種球蟲種屬中，以牛艾美耳球蟲和邱氏艾美耳球蟲2種球蟲致病力最強，且是最常見的，其他的艾美耳球蟲也可引起較小程度的感染[6]。在臨床上，對于球蟲病的診斷主要根據牛艾美耳球蟲形態學來鑒定種類，通過臨床癥狀、腸道病變及球蟲卵囊數(OPG)來鑒定球蟲病[7-8]。本研究通過調查寧夏不同地區奶牛球蟲病的流行狀況并分析其潛在的相關危險因素，從而為奶牛球蟲病的防控策略提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

小型臺式離心機購自Eppendorf公司，飽和食鹽水和離心管購自上海碧云天有限公司，40目銅絲網、60目銅絲網和麥氏蟲卵計數板購自上海富雪生物有限公司，多功能電子天平等購自中國沈陽龍騰電子有限公司，奧林巴斯生物顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

8 374份奶牛新鮮糞樣，于2014—2022年按照不同月齡采集寧夏不同地區未進行驅蟲的集約化奶牛場。采樣方法為直腸采樣或收集地面上剛排泄的新鮮糞便，采集的糞便保存于2.5%重鉻酸鉀溶液的離心管內，置于4 ℃保存，待檢。

1.2.2 球蟲卵囊計數

通過麥克馬斯特法對球蟲卵囊進行計數。取2 g糞樣置于干凈的100 mL燒杯內，加入8 mL飽和食鹽水溶液，用玻璃棒搗碎混勻糞樣，再加入50 mL飽和食鹽溶液，混勻后立即用60目篩網過濾，吸取濾液充滿2個計數室，在顯微鏡載物臺上靜置3～5 min，在10倍物鏡下鏡檢計數。每個計數室內有100個方格(1 cm×1 cm×0.15 cm)。待分別查完2個計數室100個方格內的卵囊數量n1和n2，按照如下公式計算OPG[9]。

OPG=[(n1+n2)/(2×0.15)]×60/2。

1.2.3 球蟲卵囊形態觀察

按照之前文獻描述方法[10-11]，收集保存鏡檢球蟲卵囊陽性的糞樣每份20 g，將糞樣加入50 mL離心管中，加入適量水攪拌均勻。然后用40目和60目銅篩分別過濾，向過濾后的液體中加適量PBS緩沖液，于3 500 r/min離心15 min，棄去上清液。加入適量飽和食鹽水，于2 000 r/min離心10 min，糞渣沉于管底，卵囊漂浮于飽和食鹽水表面，用移液槍吸取10 μL上清液于載玻片上，加蓋玻片后于40倍顯微鏡下觀察卵囊形態。

1.2.4 統計分析

采用SPSS軟件進行統計學分析，應用皮爾遜相關系數，確定氣候參數(平均相對濕度、降水量、平均氣溫和平均地表溫度)與感染率和均值的相關性。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同年份奶牛球蟲陽性率和感染蟲種

對比不同年份奶牛球蟲感染率，結果如圖1所示，2014—2022年奶牛球蟲平均感染率為35.90%。2014—2017年期間奶牛球蟲病的發病率呈逐年增長趨勢，2018—2019年呈下降趨勢，2019—2020年呈上升趨勢，2020—2022年呈下降趨勢。共檢出的12種艾美耳球蟲，分別是亞球形艾美耳球蟲、牛艾美耳球蟲、邱氏艾美耳球蟲、皮利他艾美耳球蟲、柱狀艾美耳球蟲、阿拉巴艾美耳球蟲、奧博艾美耳球蟲、巴西艾美耳球蟲、拔克朗艾美耳球蟲、加拿大艾美耳球蟲、橢圓艾美耳球蟲和懷俄明艾美耳球蟲(圖2)。

括號中數值表示不同年份球蟲陽性樣品數/不同年份采集的樣品總數。圖1 2014—2022年奶牛球蟲感染情況

A.亞球形艾美耳球蟲；B.柱狀艾美耳球蟲；C.橢圓艾美耳球蟲；D阿拉巴艾美耳球蟲；E.邱氏艾美耳球蟲；F.牛艾美耳球蟲；G.加拿大艾美耳球蟲；H.懷俄明艾美耳球蟲；I.奧博艾美耳球蟲；J.巴西艾美耳球蟲；K.皮利他艾美耳球蟲；L.拔克朗艾美耳球蟲。圖2 12種艾美耳球蟲形態

2.2 不同月齡奶牛球蟲病發病率、優勢蟲種及感染強度

如圖3所示，0～6月齡犢牛球蟲感染率呈明顯增長趨勢，7月齡育成牛較6月齡犢牛有所降低，8月齡育成牛較7月齡育成牛感染率再次上升，9～12月齡育成牛較8月齡育成牛感染率下降。另外，不同月齡牛的主要優勢蟲種不同，如圖4所示，1、2、4、6、9和12月齡牛的優勢蟲種為牛艾美耳球蟲，3月齡優勢蟲種為柱狀艾美耳球蟲，5月齡優勢蟲種為皮利他艾美耳球蟲，7月齡牛優勢蟲種為亞球形艾美耳球蟲，8月齡牛優勢蟲種為懷俄明艾美耳球蟲，10月齡和11月齡牛優勢蟲種為巴西艾美耳球蟲，總體分析牛艾美耳球蟲為1歲以內牛的主要優勢蟲種。不同月齡牛感染的OPG也不同，其中7月份OPG最高為2 432，12月OPG最低為387(圖5)。

括號中數值表示不同月齡球蟲陽性樣品數/不同月齡采集的樣品總數。圖3 不同月齡奶牛球蟲病檢測結果

圖4 不同月齡牛的蟲種變化

圖5 不同月齡感染牛平均OPG

2.3 不同月份球蟲病的發病率

如圖6所示，不同月份艾美耳球蟲感染率不同，其中球蟲病高發月份主要基中在4—11月份，1—6月份呈上升趨勢，7—12月份呈下降趨勢。

括號中數值表示不同月份球蟲陽性樣品數/不同月份采集的樣品總數。圖6 不同月份球蟲病感染率統計

2.4 球蟲病的風險因素分析

如表1和表2所示，艾美耳球蟲病感染率與平均相對濕度呈顯著正相關(P<0.05)，與降水量、平均氣溫、平均地表溫度呈極顯著正相關(P<0.01)。

表1 不同月份氣象數據分析結果

表2 不同因素與感染率相關性分析結果

3 討論

牛球蟲病是奶牛養殖過程中常見的一類腸道疾病，以出血性腸炎為主要臨床癥狀，可導致嚴重腹瀉、生長發育緩慢、生產性能下降，甚至死亡[12-13]。藥物是控制球蟲病的主要方式，但其使用存在著諸多問題[14]。近年來，在綠色養殖理念的指導下，減抗在養殖中得到深入的開展，但是由于尚未出現有效的替抗產品，集約化養殖中牛艾美耳球蟲的發病率和死亡率也呈上升趨勢[15-16]。

本研究于2014—2022年采集寧夏不同地區8 374份樣本，發現2014—2017年球蟲感染率呈上升趨勢，主要是因為2014—2017年寧夏地區養殖戶及科研人員對球蟲病的認識不足，沒有有效的診斷方法和及時的治療。2018—2019年球蟲感染率呈下降趨勢，是因為隨著大部分養殖企業和飼料公司對腸道寄生蟲病認識的提高，莫能菌素等藥物作為飼料添加劑進行飼喂。2019—2020年感染率再次升高，是因為2020年以來我國為了加強動物肉食品安全而推動的限抗、禁抗等工作，獸藥端限抗，飼料中則完全禁止添加抗生素，因此造成了許多地區出現了球蟲病暴發的情況，球蟲感染率也明顯提高。2020—2022年趨勢有所下降，2020年以來，隨著寄生蟲相關知識進一步的普及和培訓，養殖戶對寄生蟲感染的認識不斷提高，通過提高圈舍衛生和增強動物機體免疫力而降低感染率。

本研究通過對不同月齡的糞樣進行檢查和分析，發現0～6月齡球蟲感染率呈明顯增長趨勢，其中3～6月齡犢牛尤其易感。據走訪調查發現，大部分養殖戶缺乏科學合理的分群和飼養密度的意識，一般會根據犢牛個體大小的方法分群，斷奶、混群應激、密度和分群跨度是球蟲病感染的重要因素。正確的分群方法應是同一圈舍年齡跨度控制在1月齡以內。6～8月齡感染率雖是最高，但感染強度不大，因為此時牛體瘤胃菌群已建立，機體整體免疫力和抵抗力增強。9～12月齡的感染率雖呈現下降趨勢，但是牛體長期帶蟲，持續向外界排泄卵囊，污染環境，不斷增加牧場球蟲感染壓力。另外，不同月份感染率也不同，其中球蟲病高發月份主要集中在4—11月份。為了探究其原因，本研究通過對寧夏地區不同月份平均氣溫、降水量、平均相對濕度、平均地表溫度進行統計，發現了球蟲感染率與平均相對濕度、降水量、平均氣溫和平均地表溫度均呈顯著正相關。因此，不同月份球蟲病的發生主要與當年此月份的環境因素有關，尤其是降雨量、地表溫度和平均氣溫。

綜上所述，通過系統研究寧夏部分地區集約化奶牛場球蟲病的流行病學特征以及影響球蟲病發生的相關因素，初步揭示了寧夏地區奶牛中球蟲潛在的公共衛生安全風險，為進一步制定針對球蟲感染的高效防控方案提供依據。