豬流行性腹瀉病毒抑制干擾素λ的病毒蛋白篩選及驗證

高杰，朱雪蛟，范寶超，宋詩瑩，3，許信剛，李彬*

(1. 西北農林科技大學動物醫學院，陜西 楊凌 712100；2. 江蘇省農業科學院獸醫研究所，江蘇 南京 210014；3. 西藏農牧學院動物科學學院，西藏 林芝 860000)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)最早可追溯到1971年，首次在英國被發現，隨后流行于世界多個地區和國家[1]，2010年在中國首次暴發，造成的仔豬死亡率可高達90%[2-3]。

PED是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)導致的急性、高傳染性的病毒性腸道疾病，仔豬發病率高，死亡率高[4-5]。PEDV屬冠狀病毒科冠狀病毒屬，基因組為28 kb正鏈RNA，整個基因組至少包含了7個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，按照5′-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3′排序[6]，其中包含了S、E、M、N 4種結構蛋白和16種非結構蛋白，ORF3編碼了一種離子通道蛋白，被認為是與毒力相關的輔助蛋白[7-9]，S蛋白對于PEDV至關重要，主要負責與細胞上的受體結合，介導病毒與細胞融合，被認為是影響致病性和組織嗜性的相關蛋白[10-12]。

干擾素(interferon，IFN)是應對病毒性感染先天性免疫中重要的組成部分，其3種類型中(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型)，Ⅲ型IFN-λ被發現是IL-10細胞因子超家族成員[13-14]。人類有4種IFN-λ，分別是IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3和IFN-λ4；豬主要有IFN-λ1和IFN-λ3，IFN-λ2和IFN-λ4尚未確定[15-16]。Ⅰ型和Ⅲ型IFN的誘導過程和作用機制相似[17-19]，但由于特異性受體的表達高度受限，Ⅲ型IFN反應主要局限于上皮細胞[19]。腸上皮細胞在病毒感染后主要對Ⅲ型IFNs作出抗病毒防御反應，而腸道中的其他細胞類型依賴于I型IFN[20]。在抗PEDV感染效果上，IFN-λ1對PEDV感染的IPEC-J2細胞抗病毒活性高于豬IFN-α，且IFN-λ3較IFN-λ1有更好的抗病毒效果[21-22]。然而，病毒可以突變出多種逃逸IFN的方式，通過NSP1和N蛋白抑制IFN-λ水平[23-24]。但與之相關的報道尚不是很多。由于IPEC-J2細胞并非均質，其中只有少數對PEDV易感[23，25]。本實驗室IPEC-J2細胞均為PEDV不易感細胞株。MARC-145為PEDV易感細胞，是常被用作研究PEDV的宿主細胞之一[26]。因此，試驗中用MARC-145對PEDV感染過程中的分子機制進行進一步探索，對了解PEDV如何逃逸IFN-λ機制對PED的防治工作具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 載體、菌株、病毒和細胞

大腸桿菌Trans5α感受態細胞購自北京Transgen公司；pGL3-Basic、pRL-TK質粒及PEDV結構與非結構蛋白真核表達重組質粒由本實驗室構建并保存[27]；豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)，非洲綠猴胚胎腎細胞(MARC-145)，由江蘇省農業科學院獸醫研究所保存提供；PEDV分離株AH2012/12(登錄號：KU646831.1)由江蘇省農業科學院獸醫研究所分離、擴增和保存[28]。

1.2 主要試劑耗材

胎牛血清購自Gibco公司；PEDV-N蛋白鼠單克隆抗體由本實驗室保存；GAPDH小鼠單克隆抗體，購自Protein Tech公司；HRP 標記山羊抗鼠 IgG (H+L)購自Solarbio公司；細胞總RNA提取試劑盒FastPure Cell/TissueTotal RNA Isolation Kit V2，高保真酶Phanta Max MasterMix，逆轉錄酶HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit和熒光定量試劑SYBR Green ChamQ SYBR qPCR Master Mix，均購自諾唯贊公司；F12/DMEM培養基，DMEM高糖培養基，脂質體轉染試劑盒LipofectimineTM3000，限制性核酸內切酶SacⅠ、HindⅢ、XhoⅠ，購自Thermo Fisher公司；Poly(I：C)HMW購自InvivoGen公司；雙熒光素酶報告基因檢測系統Dual-Luciferase?Reporter Assay System購自Promega公司；T4 DNA連接酶購自ABclonal公司；質粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit I，膠回收試劑盒Gel Extraction Kit，購自Omega公司；RIPA蛋白裂解液，全黑96孔細胞培養板，購自Beyotime公司。引物和質粒測序服務委托Sangon公司合成和提供。

1.3 引物設計與合成

在GenBank中查找pIFN-λ1(Gene ID：100217388)、pIFN-λ3(Gene ID：100310828)、PEDV AH2012/12的N基因(GenBank登錄號：KU646831.1)和GAPDH 基因(GenBank登錄號：XM_007967342.2)，根據序列使用SnapGene設計定量檢測引物。使用在線啟動子預測軟件Promoter-2.0(Promoter-2.0-Services-DTU Health Tech)分析預測pIFN-λ1和pIFN-λ3啟動子區域序列，選取pIFN-λ1(-500/-1)和pIFN-λ3(-1500/-1)區域序列，使用SnapGene設計上下游含有酶切位點的重組引物。引物序列見表1。

表1 引物及序列

1.4 細胞培養及轉染

MARC-145細胞使用10%常規胎牛血清的高糖DMEM培養基，IPEC-J2細胞使用10%常規胎牛血清的F12/DMEM培養基，在含5% CO2體積濃度的37 ℃恒溫培養箱中培養。將生長狀態良好且處于對數生長期的細胞接種于24孔板，待細胞生長至70%～90%融合時使用LipofectamineTM3000轉染試劑依照說明書進行轉染。

轉錄本水平篩選PEDV蛋白，MARC-145轉染重組表達質粒12 h，同時設置空載體pLV轉染孔做對照，再轉染0.5 μg/mL Poly(I：C)12 h。啟動活性水平篩選共轉染pRL-TK 0.1 μg，啟動子質粒1 μg和NSP5 1 μg，pLV空載為對照，12 h后轉染0.5 μg/mL Poly(I：C)12 h。

1.5 PEDV感染MARC-145細胞

MARC-145細胞接種于24孔板長至單層(細胞數約105個)，使用含有5 μg/mL胰酶濃度的高糖DMEM培養基稀釋PEDV病毒原液，稀釋至每孔加入200 μL病毒感染復數(MOI)=0.1，吸附90 min。吸附后用PBS清洗1遍細胞，每孔使用500 μL 5 μg/mL胰酶濃度的高糖DMEM培養基維持細胞生長。

1.6 重組質粒構建

使用細胞總RNA提取試劑盒FastPure Cell/TissueTotal RNA Isolation Kit V2中的gDNA去除柱吸附gDNA，洗滌液清洗后用洗脫液洗脫得到IPEC-J2細胞基因組DNA，以IPEC-J2細胞基因組DNA為模板擴增pIFN-λ1(-500/-1)和pIFN-λ3(-1500/-1)片段，PCR擴增體系及擴增程序依照高保真酶Phanta Max MasterMix說明書設置，1%瓊脂糖凝膠電泳后依照膠回收試劑盒Gel Extraction Kit說明書純化目的片段，經SacⅠ/HindⅢ、XhoⅠ/HindⅢ雙酶切后使用T4 DNA連接酶連接到相同酶切處理且回收的線性pGL3-Basic載體上，構建得到熒光素酶報告基因載體pIFN-λ1-Luc、pIFN-λ3-Luc。轉化大腸桿菌5α感受態細胞，涂布于氨芐固體培養基平板，37 ℃培養12 h，挑取單克隆菌落進行菌液PCR驗證，驗證正確的單克隆菌落進行擴大培養后提取重組質粒，經雙酶切和測序驗證重組質粒的正確性。

1.7 RNA提取和實時定量PCR(RT-qPCR)

去除細胞培養基，PBS清洗1遍，依照細胞總RNA提取試劑盒FastPure Cell/ TissueTotal RNA Isolation Kit V2說明書和逆轉錄酶HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行RNA提取和cDNA合成。使用熒光定量試劑SYBR Green ChamQ SYBR qPCR Master Mix檢測細胞轉錄本pIFN-λ1、pIFN-λ3和PEDV-N相對水平。GAPDH基因作為內部參照。通過融解曲線分析確定特異性，靶基因的相對轉錄水平表示為相對于相應內參基因閾值周期(Ct值)的倍數變化，方法使用2-ΔΔCt法。

1.8 雙熒光素酶報告基因檢測

收取細胞樣品時棄去上清液培養基，用PBS清洗1遍細胞，依照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒Dual-Luciferase?Reporter Assay System說明書加入150 μL裂解液，室溫裂解20 min后將裂解液連同細胞收集在離心管中，12 000 r/min離心1 min，取上清液20 μL加入全黑96孔細胞培養板，依次加入螢火蟲熒光素酶底物和海腎熒光素酶底物，每加入1種底物，使用酶聯免疫分析儀讀取熒光數值。

1.9 Western blot檢測

蛋白樣品的制備：棄掉細胞板中培養基，加RIPA裂解液，冰上裂解10 min，加蛋白上樣緩沖液，混勻后金屬浴煮沸10 min，SDS-PAGE分析并進行Western blot鑒定。用半干轉膜法將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗膜3次，根據檢測靶標選擇對應抗體，4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次，室溫孵育對應HRP二抗60 min，PBST洗滌3次，ECL曝光檢測。

1.10 統計學分析

使用 GraphPad 8.0進行統計分析。對于每組單獨的測定，至少評估3個獨立的試驗。結果表示為“平均值±標準差”。

2 結果與分析

2.1 pIFN-λ1和λ3啟動子質粒構建及鑒定

使用細胞RNA提取試劑盒，裂解正常生長的IPEC-J2細胞，將基因組DNA吸附柱上的DNA洗脫作為模板進行PCR擴增，在500和1 500 bp左右各出現1條條帶，與目的條帶的大小一致(圖1)。啟動子區域序列擴增成功。將目的條帶純化回收，雙酶切后連接在pGL3-Basic載體得到pIFN-λ1-Luc、pIFN-λ3-Luc，經菌液PCR、雙酶切(圖2)及測序驗證重組質粒的正確性，結果表明重組質粒構建成功。

M. DNA 標準 DL2000；1. pIFN-λ1(-500/-1)擴增產物；2. pIFN-λ3(-1500/-1)擴增產物。圖1 pIFN-λ1和pIFN-λ3啟動子序列片段PCR結果

M. DNA標準DL2000；1. pIFN-λ1-Luc雙酶切鑒定；2. pIFN-λ3-Luc雙酶切鑒定。圖2 pIFN-λ1-Luc和pIFN-λ3-Luc雙酶切鑒定

***表示P<0.001，下同。圖3 pIFN-λ1和pIFN-λ3的啟動子啟動活性驗證

2.2 pIFN-λ1-Luc和pIFN-λ3-Luc啟動子活性的驗證

IPEC-J2細胞接種24孔板長至70%以上融合，每孔共轉染pRL-TK 0.1 μg和啟動子質粒1 μg，12 h后再次轉染0.5 μg/mL Poly(I：C)12 h，收取細胞樣品進行雙熒光素酶報告基因檢測。結果與轉染空載體的對照組相比，轉染pIFN-λ1-Luc和pIFN-λ3-Luc的熒光數值極顯著升高(P<0.001)，證明pIFN-λ1和pIFN-λ3的啟動子具有良好的啟動活性。

2.3 PEDV感染對IFN-λ1和IFN-λ3轉錄水平的影響

MARC-145細胞接種24孔板，以MOI=0.1感染PEDV，以只轉染0.5 μg/mL Poly(I：C)12 h的細胞為陽性對照，在感染后的0、4、8、12 h收取試驗組細胞，用于實時熒光定量PCR和Western blot檢測。結果顯示，PEDV在MARC-145中可以復制(圖4)。由圖5可見，在感染PEDV 12 h引起IFN-λ1轉錄本水平顯著降低，其余時間點均未引起IFN-λ1和IFN-λ3顯著變化。

A. Western blot檢測；B. 熒光定量PCR檢測。圖4 PEDV在MARC-145細胞上的增殖情況

**表示P<0.01，下同；A. PEDV對IFN-λ1 mRNA的影響；B. PEDV對IFN-λ3 mRNA的影響。圖5 細胞感染PEDV后IFN-λ轉錄水平的變化

細胞共轉染pRL-TK和啟動子螢火蟲熒光質粒12 h，以MOI=0.1感染PEDV，以轉染0.5 μg/mL Poly(I：C)12 h的細胞為陽性對照，感染后的0、4、12 h收取細胞樣品進行雙熒光素酶報告基因檢測，結果發現，感染PEDV引起IFN-λ1和IFN-λ3啟動活性顯著升高(圖6A、6B)，但與陽性對照較高倍數升高相比，啟動活性仍然較低。

*表示P<0.05，下同；A. PEDV對IFN-λ1啟動水平的影響；B. PEDV對IFN-λ3啟動水平的影響。圖6 細胞感染PEDV后IFN-λ啟動水平的變化

2.4 PEDV抑制Poly(I：C)誘導的IFN-λ1和IFN-λ3的升高

設置Mock組、Poly(I：C)組、PEDV組和PEDV+Poly(I：C)組。MARC-145細胞生長至單層感染PEDV，用基礎培養基代替病毒液處理對照組，12 h后轉染0.5 μg/mL Poly(I：C)12 h，結果表明感染PEDV組在轉錄本水平顯著降低IFN-λ1和IFN-λ3(圖7A、7B)。

A. PEDV對Poly(I：C)處理的IFN-λ1 mRNA水平的影響；B. PEDV對Poly(I：C)處理的IFN-λ3 mRNA水平的影響；C. PEDV對Poly(I：C)處理的IFN-λ1啟動水平的影響；D. PEDV對Poly(I：C)誘導的IFN-λ3啟動水平的影響。圖7 PEDV對Poly(I：C)處理的細胞的IFN-λ調控

為檢測PEDV感染MARC-145細胞是否能引起Poly(I：C)激活的IFN-λ1和IFN-λ3啟動活性變化，在細胞生長至70%融合時轉染雙熒光素酶報告基因質粒12 h，而后感染PEDV 12 h，再轉染0.5 μg/mL Poly(I：C)處理細胞12 h，收取細胞進行雙熒光素酶報告基因的檢測。結果顯示IFN-λ1的熒光素酶活性由陽性對照的15倍下降至6倍，IFN-λ3由40倍下降至不到20倍，表明PEDV抑制Poly(I：C)誘導的IFN-λ1和IFN-λ3升高(圖7C、7D)。

2.5 篩選抑制IFN-λ1和IFN-λ3的PEDV蛋白

MARC-145細胞轉染pLV-mCherry載體的PEDV蛋白重組質粒，在倒置熒光顯微鏡下觀察到Cherry熒光(圖8)，表明所有重組質粒均正常表達。

A. NSP1；B. NSP2；C. NSP3；D. NSP4；E. NSP5；F. NSP6；G. NSP7；H. NSP8；I. NSP9；J. NSP10；K. NSP12；L. NSP13；M. NSP14；N. NSP15；O. E；P. M；Q. N；R. S；S. ORF3。圖8 PEDV重組蛋白表達(100×)

MARC-145細胞轉染PEDV重組表達質粒后再轉染Poly(I：C)處理細胞，收取細胞樣品檢測轉錄本IFN-λ1和IFN-λ3的水平變化，結果顯示NSP1、NSP5、NSP9和ORF3顯著抑制IFN-λ1的表達(圖9A)，NSP1、NSP5、NSP8和ORF3顯著抑制IFN-λ3的表達(圖9C)。

A.病毒蛋白對Poly(I：C)處理后IFN-λ1 mRNA水平的影響；B. 病毒蛋白對Poly(I：C)處理后IFN-λ3 mRNA水平的影響；C. NSP5對Poly(I：C)處理后IFN-λ1啟動活性的影響；D. NSP5對Poly(I：C)處理后IFN-λ3啟動活性的影響。圖9 抑制IFN-λ1/3的PEDV蛋白篩選

為了進一步驗證NSP5對IFN-λ1和IFN-λ3啟動活性也具有抑制效果，利用雙熒光素酶報告系統驗證NSP5對IFN-λ1和IFN-λ3啟動活性的作用。結果顯示IFN-λ1和IFN-λ3的熒光素酶活性與陽性對照相比均下降至50%以下(圖9B、9D)，表明NSP5顯著抑制了IFN-λ1和IFN-λ3的啟動活性。

3 討論

PEDV作為一種以糞口途徑傳播為主的病毒，其主要感染和增殖的部位是豬小腸上皮細胞[29]。因此，小腸黏膜是PEDV感染宿主所要突破的第一道防線。雖然Ⅰ型干擾素α和β已經是公認的重要抗病毒因子，但研究發現，其與Ⅲ型干擾素λ有明顯的表達差異性，Ⅰ型干擾素α/β主要在腸道淋巴結中發揮抗病毒作用，而在腸道黏膜的表達水平遠不及IFN-λ[30]，且IFNL-λ已被證實具有良好的抵抗PEDV感染作用[21-22]。目前，Ⅰ型干擾素逃逸PEDV感染的機制已得到廣泛研究，但有關PEDV逃逸IFN-λ的研究鮮有報道。現有文獻報道，NSP1、NSP3、NSP5、NSP8、NSP14、NSP15、NSP16、ORF3、E、M和N均有可能參與了逃逸宿主IFN-λ1的過程，其中以NSP1、NSP14和ORF3抑制效果較為顯著，NSP1阻斷IRF1的核易位并減少過氧化物酶體的數量以抑制IRF1介導的Ⅲ型IFN[23]；N蛋白通過阻斷NF-κB的核易位干擾IFN-λ的產生[24]。但更多分子作用機制尚不明確，PEDV蛋白介導的IFN-λ免疫逃逸機制仍有巨大的探索空間。

試驗中首先確定了PEDV感染MARC-145細胞未能引起IFN-λ1/3轉錄本水平的升高，啟動活性有3至5倍升高，又將感染PEDV的細胞使用Poly(I：C)處理，證實了PEDV在轉錄本水平和啟動活性水平都具有抑制IFN-λ1/3的能力，最后對不同PEDV蛋白進行篩選和驗證，NSP1、NSP5、NSP8、NSP9和ORF3均有對IFN-λ的抑制效果，其中NSP5對IFN-λ的下調作用最為顯著，且抑制IFN-λ3效果較抑制IFN-λ1更為明顯。整個試驗運用了熒光定量PCR和報告基因兩種方法，試驗結果相互佐證，檢測IFN-λ轉錄本水平的變化，通過報告基因檢測則有更加靈敏、重復結果穩定的優勢。