不同質地植煙土壤細菌多樣性對生物有機肥的響應

張 倩, 赫英宇, 王 波, 郭 慧, 孫軍偉, 楊惠娟

(1.河南農業大學煙草學院,河南鄭州 450002; 2.黑龍江省煙草公司牡丹江煙葉公司,黑龍江牡丹江 157011;3.湖北中煙工業有限責任公司,湖北武漢 430077; 4.云南省煙草公司大理州公司,云南大理 671000)

土壤中存在著許多微生物,這些微生物在土壤中的適應性是有差別的[1],土壤 pH值、質地、養分、水分和溫度都會對土壤中的微生物進行調控[2]。微生物多樣性、土壤呼吸和微生物生物量等生物因子對土壤健康起著重要作用,微生物肥料的作用是通過微生物的生命活動,可以使多種營養物質之間相互補充,并在一定程度上改善了土壤的結構。微生物群落結構的差異性與土壤類型密切相關,土壤微粒的細致程度與有機質含量和微生物變化的緩沖能力成正比關系,而與微生物群落結構的變化成反比關系[3]。壤土、黏壤土、黏土在門層次上微生物群落構成相似,但豐度有一定差異;3種質地土壤的菌類成分及相對富集程度均無顯著差異[4]。

煙草作為我國最重要的經濟作物之一,合理種植可以提高產量,增加農民收入[5],肥料的合理施用在一定程度上決定著作物的成長[6]。在煙葉種植中,為了提高產量,大量施用化肥、農藥,引起土壤退化,從而導致作物產量的降低[7-9]。因此,如何選擇適宜的有機肥改善土壤問題,提高作物產量,是目前的研究熱點[10]。據報道,土壤微生物的多樣性和活力對肥料的反應機理是比較復雜的,土壤微生物的多樣性活力受多種因素影響,不同的肥料也會對土壤產生不同的影響[11]。土壤微生物種類、數量及其變化是土壤有機質礦化速率和多種營養物質分布狀況的一個重要指標,能夠直接影響土壤的供肥狀況[12]。而土壤深度、土壤質地對培肥效果的影響更為明顯[13]。

不同的施肥處理對土壤的影響是顯著不同的,目前已有的一些研究表明,肥料的作用是通過提高土壤中的糖類和苯酚類物質含量作為碳源,從而達到調控或緩解連作對煙草生長的作用[14];研究貴州植煙土壤得出,長期施用有機肥能提高該區土壤有機質含量和改良土壤微生物群落[15];研究表明,在施肥前期,土壤中的微生物群落結構變化顯著,而在后期則無顯著變化[16-20]。施肥促進土壤中微生物群落的活性和多樣性[21]。因此,通過分析不同質地土壤秸稈還田配施腐熟劑的土壤細菌優勢菌群,可為在不同質地的土壤中選擇腐熟劑提供一定有價值的參考。

宏基因組是指利用特定環境中所有微生物的基因組進行基因序列分析,從而解決了常規方法無法獲得完整的土壤微生物信息的不足[22]。通量大、可擴展性好、費用低、技術快速、準確率高等是第二代高通量測序技術的特點,能為土壤微生物群落提供良好的信息[23]。利用高通量 Illumina Miseq技術可對煙葉根際土壤中的微生物多樣性和細菌群落結構進行較為全面的分析[24]。據了解,不同質地土壤細菌多樣性差異研究較多,而細菌多樣性對有機肥的響應研究較薄弱[25]。本研究通過運用高通量測序技術研究了連作條件下不同施肥處理對云南大理植煙土壤微生物群落結構多樣性及改良土壤環境的影響,旨在為生物有機肥的合理配施提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在云南省大理州彌渡縣紅巖鎮西雙村進行(25°23′8″N,100°24′23″E,海拔1 729.5 m,中亞熱帶季風氣候區),年均氣溫17.3 ℃,年均降水量824.4 mm。土壤類型為2種,分別是中壤土、輕壤土,試驗煙田為多年連作。本試驗所用的2種質地(輕壤土D1、中壤土D2)的土壤理化性狀見表1。

表1 不同質地土壤理化性狀

1.2 試驗設計

大田試驗采用田間小區試驗,在選定的輕壤土(D1)、中壤土(D2)試驗地實施化肥與不同種類有機肥配施試驗,本試驗設置了6個不同的處理,并且采用隨機區組設計。D1設置3個處理,分別為T1:在輕壤土中,移栽前塘施三炬微生物菌肥50 kg/667 m2,其他按照常規施肥;T2:在輕壤土中,起壟前條施國發商品有機肥100 kg/667 m2,其他按照常規施肥(有機肥對照);T3:常規施肥(常規對照)。D2設置3個處理,分別為T1:在中壤土中,移栽前塘施三炬微生物菌肥50 kg/667 m2,其他按照常規施肥;T2:在中壤土中,起壟前條施國發商品有機肥 100 kg/667 m2,其他按照常規施肥(有機肥對照);T3:常規施肥(常規對照)。試驗處理見表2。使用大理煙草公司提供的煙草專用復合肥為對照,總養分≥44%,N、P2O5、K2O含量分別為10%、10%、24%。每個試驗設置3次重復,行距和株距分別為120 cm和60 cm,四周設保護行。試驗處理均施用煙草專用肥40 kg/667 m2。烤煙品種為紅花大金元,各處理間的田間管理措施都按照當地優質煙葉生產技術標準進行。

表2 大田試驗處理

大田試驗于2019年4月22日開始,2019年10月結束。還苗期是4月26日至6月2日,團棵期是6月3—13日,旺長期是6月27日,現蕾期是6月28日至7月5日,成熟期是7月6日至8月31日并且收獲完畢。

福建三炬固體微生物菌肥處理T1施肥方式為窩施;彌渡國發有機肥處理T2施肥方式為條施;肥料:彌渡國發有機肥、福建三炬固體菌肥的技術指標等見表3。

表3 2個肥料的技術指標及生產廠家

1.3 測定項目與方法

在煙株處于團棵期(T)、旺長期(W)、第1次采收前(C1)、第2次采收前(C2),采集煙株根部 10 cm 處的根際土壤,取樣方法為五點取樣法,分別對相同處理后的土樣進行混合均勻,再按照四分法對所取樣品進行取樣,稱取100 g土樣,并用滅菌過的自封袋裝好,然后進行土壤總 DNA提取、庫構建、測序等工作。

1.4 測序數據預處理與分析

1.4.1 數據質控 將 DNA上樣于1%的瓊脂糖凝膠孔內,用120 V恒壓電泳法進行15 min的檢測,并在紫外線和透射光下進行觀察,用于查看DNA的完整度和濃度。PCR引物如下:前端引物343F-5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′;后端引物:798R-5′-AGGGTATCTAATCCT-3′[26]。對原始數據進行拼接 (FLASH,version 1.2.11),然后對拼接后的序列進行質量過濾,消除嵌合體(UCHIME,version 2.4.2),從而獲得高品質的 Tags序列。用TruSeqTMDNA Sample PrepKit構建PE文庫,在Illumina Miseq平臺上進行序列分析。

1.4.2 生物信息學分析 高通量的排序結果是最初的雙端序列,也就是所謂的數據;接著,采用 Trimmomatic (版本0.35)軟件[27],首先用滑動窗口法掃描 raw數據,當質量小于20時,刪除具有低于閾值的堿基質量平均值的滑窗,而長度小于50 bp的序列被淘汰[28];然后,利用 Flash[29]軟件(版本1.2.11),將上一步的標準雙端數據進行拼接,得到了最大長度200 bp的序列,從而得到完整paired序列;在 QIIME中將包含N個堿基的序列用split_libraries (version1.8.0)刪除,將單個堿基重復數大于8的序列剔除,再剔除長度小于200 bp的序列,得到一個 clean tags序列;然后,利用 UCHIME (version 2.4.2)來移除 clean tags中的嵌合體,最后獲得 OTU分區的valid tags;并利用歐易自己編寫的程序對質量控制進行了統計,得出了相應的數據。

1.4.3 數據分析 數據分析采用微軟 Excel 2016進行,方差分析采用 SPSS 22軟件對數據進行分析,采用Duncan’s多重檢驗方法對各處理在0.05水平進行了差異顯著性檢驗。使用Canoco 5.0軟件對土壤中的細菌屬和養分進行 DNA分析,通過熱圖對各菌種或樣本量的豐度相似程度進行聚類,將20個主要菌群按門類劃分,并采用不同的顏色和長度來表示細菌群落成分的差異和比例,利用 UPGMA技術對樣本進行了豐度相似度的聚類分析。應用 SPSS 19.0對各處理間各因子進行了方差分析,并進行了統計學上的顯著性分析。其中,功能多樣性指數為Simpson指數、Goods Coverage指數、Chao指數、Shannon-Wiener指數。

Chao指數估算了該群落中的種群數量[30]:

式中:Sobs表示實際測量出的OTU數目;n1表示僅包含1條序列的OTU數量;n2表示僅包含2條序列的OTU數量。

香農指數(Shannon-Wiener指數)包括了2個部分,一是物種數量,二是不同個體之間分布的均勻性。Shannon 指數計算公式:

式中:Ni表示含有i條序列的OTU數目;N表示所有的序列數。

辛普森指數(Simpson指數)是一種常見的群落多樣性指標,由Simpson提出[31],是指2個被隨機選擇的個體,屬于不同種類的可能性。辛普森指數愈高,說明群落的多樣性愈高。

Goods Coverage指數也是一種多樣性指數,由Esty最先提出[32]。指數越接近1,表明序列的深度基本覆蓋了樣品的全部類型。

式中:Cdepth表示測序的深度。

2 結果與分析

2.1 測序序列數據統計

項目共72個樣本,每個樣本重復3次,經分析,所有處理的測序結果均已達標,可以用于后續分析。用97%的相似度來進行聚類,獲得了 8 781 個 OTU,在質控后,Clean Tags的分布范圍為22 443.00～50 078.33,除掉嵌合體之后獲得valid tags(也就是最終要分析的數據),在 19 510.33～45 413.67 bp之間,valid tags的平均長度為427.97～431.40 bp,而各個樣品的 OTU數量在 1 277.33～1 951.33之間(表4)。

表4 植煙根際土壤微生物OTC數量

總體上,測序包含了煙葉的整個生命周期,因此土樣測序的整體趨勢為煙葉第1次采收(C1)>煙葉第2次采收(C2)>旺長期(W)>團棵期(T);并且在各個時期地塊D1整體序列高于地塊D2。其中在團棵期間,施用微生物菌肥的處理T1高于其他處理,施用國發有機肥的處理T2次之,常規施肥T3最少,但是T3的有效序列所占百分比最高;在旺長期間,施用T2處理最好,T1處理次之,T3最弱;在采收期間,常規施肥T3處理最好,但差距不大;可知在常規施肥的條件下加施肥料,可以增強煙葉前期土壤微生物的活躍。

2.2 植煙土壤的稀釋曲線

稀釋曲線中曲線能否達到平臺期可以說明測序數據能夠覆蓋微生物群落的多樣性。圖1中對72個植煙土壤進行測序,其中1條曲線表示1個樣品,橫坐標是隨機取樣的深度(也就是取樣的序列數),而縱坐標是指數值。當測序數目達到1 700以后,細菌稀釋曲線趨于平緩,這就說明此樣本的測序結果是正確的,而更多的樣本中可能會有少量的新的OTU,反之,若繼續進行測序,將會產生更多的新的 OTU。

2.3 植煙土壤的Alpha 多樣性分析

Alpha多樣性分析又稱為生物境內的多樣性,它是用不同的 alpha多樣性指數來評估樣本中的物種豐富程度和分布均勻程度。由表5可知煙草根際土壤樣本Alpha多樣性統計結果。試驗結果顯示,該試驗所建的土壤微生物庫覆蓋范圍均在80%以上,反映了該地區土壤微生物多樣性的真實、有效性,有一定的應用價值;總體香濃指數高于8,表明煙草根際土壤樣品的細菌群落多樣性較高,土壤中的細菌種類較多,并且在采收期間細菌多樣性更為豐富。在各個時期中可以看出地塊D1與地塊D2差異不明顯,其中施用微生物菌肥的土壤中細菌含量最大,施用國發有機肥的土壤中細菌含量次之,常規施肥含量最小;而Simpson指數值越大,生物多樣性越低,圖中可知施用微生物菌肥的處理Simpson指數最小,因此其生物多樣性越多;群落豐富度的增高隨著Chao指數增加而增加,呈正相關;不同土壤樣本之間生物多樣性指數存在差異,施用微生物菌肥的土壤的香濃指數、Chao1 指數均高于其他處理,Simpson指數低于其他處理,結果表明,施用微生物菌肥的土壤生物多樣性相比更為豐富,其原因可能在于微生物菌肥的應用有利于微生物的生長。

表5 不同施肥處理下植煙土壤的Alpha 多樣性分析

2.4 煙草根際土壤細菌在門水平上的分布

土壤中的微生物群落分布較為穩定,各菌種間的穩態分布特征相互影響,從而為土壤提供了有利的生態條件。在 OTU物種注釋結果的基礎上,選擇了10個各樣本豐度最好的物種,并且根據這10個物種完成了相對豐度柱狀累積圖的繪制。根據圖2可以得到,OTU注釋統計聚類到16個門,變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門 (Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、綠彎菌門 (Chloroflexi)、髕骨細菌門(Patescibacteria)、藍細菌(Cyanobacteria)在各組樣品中是優勢菌門。

其中變形菌門的豐度含量最高(39%～63%),其次是放線菌門(15%～23%)和芽單胞菌門(4%～13%),相對百分比之和為97.56%。從整體看,煙株整個生長期間,豐度最活躍的變形菌門趨勢為團顆期(T)>旺長期(W)>采收期(C),放線菌門以旺長期最為活躍,芽單胞菌門在采收期相對活躍,并且在團顆期施加微生物菌肥的處理T1的變形菌門相對豐度>對照,這就說明施加微生物菌肥在煙葉生長團顆期間發揮效用最強;從地塊來看,各組樣品優勢菌門豐度趨勢為地塊D1>地塊D2,在團顆期最為顯著;在中壤土中施用微生物菌肥的處理在采烤第1次前(即D2-T1-C1)擬桿菌門、厚壁菌門豐度比例明顯高于其他樣品;而酸桿菌門、芽單胞菌門豐度比例低于其他處理。值得關注的是,綠彎菌門在輕壤土中采收期間施加微生物菌肥的處理中顯著增加。

2.5 煙草根際土壤細菌在屬水平上的分布

在OTU物種注釋結果的基礎上,選擇了10個各樣本屬水平上豐度最好的物種,并且根據這10個物種完成了相對豐度柱狀累積圖的繪制。根據圖3可以得到,OTU注釋統計聚類到31個屬,其中羅丹桿菌屬(Rhodanobacter)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、雙子星菌屬(Gemmatimonas)、丘氏桿菌屬(Chujaibacter)、諾卡德菌屬(Nocardioides)、假桿菌屬(Pseudarthrobacter)、馬爾莫里科拉菌屬(Marmoricola)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、苔蘚桿菌屬(Bryobacter)、鏈霉菌屬(Streptomyces)是各組樣品中的優勢菌屬。其中豐度含量相對最高的是落單桿菌屬(1%～30%),其次是鞘脂單胞菌屬(0.7%～9%)和雙子星菌屬(0.3%～5%),從整體看,在煙株整個生長期間,豐度最活躍的落單桿菌屬趨勢為團顆期(T)>旺長期(W)>采收期(C),羅丹桿菌屬以團顆期最為活躍,鞘脂單胞菌屬在各個時期穩步增長,雙子星菌屬在采收期相對活躍,并且在團顆期施加國發商品有機肥的處理T2的落單桿菌屬相對豐度>施加微生物菌肥的處理T1>對照,這就說明施加菌肥在煙葉生長團顆期間可以發揮效果;從地塊來看,各組樣品優勢菌屬豐度趨勢為地塊 D1>地塊D2,在團顆期最為顯著,說明中壤土配施中菌肥使土層細菌結構發生明顯變化。

2.6 熱圖

在對 OTU序列進行注釋后,用 Hatmap表示,并利用熱圖的色彩梯度和相似性差異,可以清楚地觀察到不同的樣品之間的差異,進而進行分析。

從顏色方面的reads數目看,植煙土壤微生物菌類隨著時間的延長而增多,且豐度比較強。煙株生長期間,植煙土壤微生物菌類在各個時期豐度不同,在團顆期、旺長期間羅丹桿菌屬、丘氏桿菌屬、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)豐度顯著,而在采收期雙子星菌屬、東加菌屬、Ellin6067、Pseudolabrys、Bradyrhizobium豐度顯著;整體上施用微生物菌肥的處理T1相對于對照組CK增加了豐度。施用國發有機肥的處理T2的微生物菌類豐度較弱(圖4)。

3 討論

施用微生物菌肥能顯著增加土壤中的細菌Shannon指數和Simpson指數,與楊昊等的結果[33]相吻合。本研究通過施用微生物菌肥,對種植煙株不同時期土壤中的細菌多樣性進行了研究。試驗結果發現,不同質地的土壤細菌群落中Simpson指數和Shannon指數有明顯的差異,說明施用微生物菌肥后的土壤相比對照土壤中的細菌群落多樣性增高,且差異顯著。

不同質地的土壤中,細菌的物種分布和多樣性豐富程度存在差異;不同土壤類型、不同深度對微生物群落的結構和成分有顯著的影響。土壤的各種特性決定了土壤微生物群落的多樣性[34-38],不同的施肥處理對土壤微生物有不同的影響,施用微生物菌肥的煙葉通過根際分泌物對根際微生物群落的結構和成分構成有一定的影響。本研究對10種主要菌門進行了分析,結果表明:變形菌門、放線菌門、芽單胞門、擬桿菌門和酸桿菌門為優勢菌門,這一結果與多數學者的研究結果相一致。變形菌門是土壤微生物中最重要的一類,其代謝活動是微生物活動的主體,是構成土壤微生物的重要組成部分,而且在土壤中比較穩定。云南大理煙草連作中壤土和輕壤土中,相對豐度最高的土壤細菌是變形菌門,第二和第三分別是放線菌門和芽單胞菌門;中壤土、輕壤土配施三炬微生物菌肥以及國發有機肥改變土壤優勢菌種;中壤土配施微生物菌肥增加了丘氏桿菌屬豐度,丘氏桿菌屬在各個時期均是土壤中主要細菌類群,說明其在煙葉的生長中起著重要作用。丘氏桿菌屬具有較高的代謝能力,并且生理特性多功能,在環境保護方面具有一定的發展前景。中壤土配施國發有機肥后增加了羅丹桿菌屬相對豐度;試驗土壤樣品中的主要細菌群落動態變化表現為:羅丹桿菌屬、鞘脂單胞菌屬、雙子星菌屬和丘氏桿菌屬等,數量最多的是羅丹桿菌屬,并且種類豐富,為優勢菌株;本研究中中壤土配施微生物菌肥增加了丘氏桿菌屬豐度,丘氏桿菌屬在各個時期均是土壤中主要細菌類群,說明其在煙葉的生長中起著重要作用。中壤土配施國發有機肥后增加了羅丹桿菌屬相對豐度,微生物菌肥和國發有機肥含有綠色木霉和絲狀菌,對纖維素的分解能力較強,土壤施入微生物菌肥后,土壤中的細菌、真菌各菌種間的良性效應得到了明顯的改善,同時還表現出了一種與土著菌的競爭和協同效應。

4 結論

本研究中,不同質地下活躍的微生物菌門都為變形菌門;中壤土微生物菌肥中重要作用的微生物類群為鞘脂單胞菌屬;而輕壤土重要作用的微生物類群為羅丹桿胞菌。中壤土施用國發有機肥、微生物菌肥土壤細菌多樣性差異不明顯,但較常規施肥土壤細菌多樣性差異明顯;輕壤土配施中微生物菌肥細菌多樣性差異明顯。因此,綜合試驗來看,不同質地施用肥料對土壤細菌多樣性差異明顯,施用肥料可在不同程度上改善植煙土壤,但應因地制宜施用微生物菌肥。