Mzb1通過內質網應激途徑改善過氧化氫所致人心肌細胞損傷的研究

薛姣姣 顧晶 張棋 周明生 姚陽 蔡瑞平 徐茜 徐志華 賈輝 張璐

心肌梗死是全球發(fā)病率和死亡率的主要原因[1]。隨著藥物治療的應用越來越多以及幾種冠狀動脈再灌注策略的出現(xiàn)，急性心肌梗死的治療、護理和預防取得了顯著進展。心肌梗死的病理生理機制包括心肌細胞凋亡、炎癥、鈣超載和活性氧（reactive oxygen species，ROS）相關損傷也逐漸被揭示，但很少闡明循證策略來預防心肌梗死損傷[2]。因此，需要深入探索心肌梗死發(fā)生機制，尋找診斷、預防、治療心肌梗死的新靶點。心肌梗死發(fā)生后引起細胞內質網應激的發(fā)生，較短時間的內質網應激可以對細胞起到一定的修復和緩解作用，而持續(xù)的內質網應激則會引起不可逆的細胞凋亡。內質網應激因子CCAAT/增強子結合蛋白的同源蛋白（CCAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP）、葡萄糖調節(jié)蛋白94（glucoseregulated protein 94，GRP94）等均參與心肌梗死過程[3-4]。尋找抑制內質網應激過度發(fā)生的方法可以作為心肌梗死治療的有效手段。緣區(qū)B 和B1 細胞特異性蛋白（marginal zone B and B1 cell specific protein，Mzb1）是一種B 細胞特異性編碼蛋白，主要定位于內質網上，在內質網應激條件下作為底物特異性伴侶GRP94 的輔助伴侶發(fā)揮作用，并參與對整合素β1的激活[5-6]。此前，關于Mzb1 作用的研究主要集中在免疫性疾病、癌癥和慢性淋巴細胞白血病[7-8]。然而，Mzb1 是否在其他炎癥性疾病中發(fā)揮重要的作用一直受到質疑。前期研究顯示，心肌梗死組織中Mzb1 的表達下降，沉默Mzb1 會加重心肌細胞損傷，過表達Mzb1 可以恢復線粒體功能改善心肌損傷[9]。基于前期的研究，本實驗探索Mzb1 對過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導的人心肌細胞損傷內質網應激相關因子及凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人永生化心肌細胞（AC16）由哈爾濱醫(yī)科大學提供。高糖培養(yǎng)基購于美國Cytiva 公司；牛血清白蛋白、青鏈霉素雙抗混合液、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二 苯基四氮唑溴鹽[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT] 檢 測 試 劑 盒、luriabertani（LB）培養(yǎng)基與氨芐青霉素鈉（ampicillin）購于北京索萊寶生物科技有限公司；胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）消化液購于天津灝洋生物制品科技有限責任公司；超敏化學發(fā)光底物（enhanced chemiluminescent，ECL）購于上海碧云天生物技術有限公司；Mzb1 一抗抗體購于美國Abcam 公司；GRP94、CHOP、Caspase3 以及3- 磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗抗體購于武漢Proteintech 公司；Mzb1 過表達質粒（氨芐霉素抗性）購于武漢維諾賽生物技術有限公司；Lipofectamine?3 000 購于美國Invitrogen 公司；質粒提取試劑盒購于美國愛思進公司。

1.2 方法

此文的研究體現(xiàn)了《精編分子生物學實驗指南》[10]的執(zhí)行標準。

1.2.1 AC16 細胞培養(yǎng)

AC16 細胞培養(yǎng)在含有10%的胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）及1%青鏈霉素雙抗的高糖完全培養(yǎng)基中（dulbecco's modified eagle medium，DMEM），置于含有37℃、5%CO2和95%空氣的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細胞匯合度達90%以上，用胰蛋白酶消化細胞，將混懸細胞分別接種于6 孔板及96 孔板，用于后續(xù)實驗研究。加入終濃度為200 μmol/L 的H2O2或等體積高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集細胞用于下一步實驗的檢測。

1.2.2 Mzb1 質粒擴增

取10 μL 質粒與100 μL 感受態(tài)細菌混勻后冰浴30 min，42 ℃熱激45 s，立即置冰上放置2 min，加入預熱至室溫的400 μL LB 培養(yǎng)基，37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)1 h，4 000 rpm 離心1 min，棄去400 μL 培養(yǎng)上清，剩余100 μL 用移液器混勻后均勻涂布于含100 μg/mL Ampicillin 抗性的LB 平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。挑取3 個單菌落接種于含5 mL，100 μg/mL Ampicillin抗性的LB 培養(yǎng)液中，250 rpm，37℃恒溫搖床培養(yǎng)過夜，用小量質粒抽提試劑盒按照步驟抽提質粒，采用微量分光光度計測量濃度，稀釋質粒濃度約500 ng/μL，-20℃保存。

1.2.3 細胞轉染

將AC16 細胞按照1.0×105/ 孔的密度接種與6 孔板，培養(yǎng)12 h；待細胞匯合度達到70%～90%后，根據(jù)Lipofectamine?3 000 說明書轉染質粒，制備質粒DNA-脂質體復合物；加入DNA-脂質體復合物至細胞；放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，收集細胞用于進一步的檢測。

1.2.4 MTT 實驗檢測細胞活力

將AC16 細胞按照3.0×103/孔接種于96 孔板，培養(yǎng)12 h；按照細胞分組處理細胞；設置分組：對照組、H2O2組、Mzb1+H2O2組；用5 mg/mL MTT（20 μL/孔）處理細胞4 h。小心地吸出DMEM 保留結晶，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（150 μL/孔），室溫狀態(tài)下放置水平搖床10 min；使用熒光酶標儀檢測490 nm 波長的吸光度值。

1.2.5 蛋白質印跡法（western blot，WB）檢測細胞內Mzb1、GRP94、CHOP、Cleaved-caspase3 蛋白水平的變化情況

將細胞接種于6 孔板培養(yǎng)12 h；按照細胞分組處理細胞；設置分組：對照組、H2O2組、Mzb1+H2O2組；采用細胞裂解液裂解細胞，超聲離心后，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）法檢測蛋白濃度，將樣品標準化濃度后，100℃變性7 min。配制SDS-PAGE 凝膠電泳分離，然后轉至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，5% BSA 室溫搖床封閉1 h。加入Mzb1（1 ∶500）、GRP94（1 ∶500）、CHOP（1 ∶500）、Caspase3（1 ∶500）、GAPDH（1 ∶2 000）一抗，于4℃孵育過夜。次日TBST 洗膜后用二抗（1 ∶4 000）孵育1 h，再次洗膜后用ECL 顯影，并采用ImageJ 軟件進行分析。蛋白相對表達量＝目的蛋白灰度值/ 內參灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用Prism 8.4.0 軟件進行分析。計量資料以（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 H2O2 損傷心肌細胞的活力

當AC16 細胞匯合度達70%左右，分別給予各組細胞200 μmol/L H2O2或體積高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，采用MTT 檢測各組的細胞活力。實驗結果顯示，對照組細胞活力為（100.000±8.767）%，H2O2組細胞活力為（33.250±4.956）%；與對照組相比，H2O2處理的AC16 心肌細胞活力明顯降低（t＝3.896，P＜0.01）。見圖1。

圖1 H2O2 處理后對AC16 細胞活力的影響

2.2 H2O2 引起心肌細胞內質網應激

接下來，檢測H2O2引起的細胞內內質網應激水平變化。采用WB 檢測內質網應激相關分子GRP94 以及CHOP的表達水平。結果顯示，在對照組細胞中，GRP94 蛋白相對表達量為（1.000±0.000），在H2O2組中，GRP94 的蛋白相對表達量為（1.713±0.046）；在對照組細胞中，CHOP蛋白相對表達量為（1.000±0.000），在H2O2組中CHOP 的蛋白相對表達量為（2.512±0.553）；與對照相比，H2O2處理后引起細胞內GRP94（t＝15.660，P＜0.05）以及CHOP（t＝2.736，P＜0.05）蛋白表達量明顯升高。見圖2。

圖2 H2O2 引起AC16 細胞內質網應激發(fā)生

2.3 H2O2 引起AC16 心肌細胞Mzb1 表達下調

WB 檢測結果顯示，對照組內Mzb1 的蛋白相對表達量為（1.000±0.000），H2O2處理的AC16 細胞中Mzb1 的蛋白相對表達水平為（0.455±0.066）。H2O2處理后引起細胞內Mzb1 的表達顯著下降（t＝16.490，P＜0.05）。Mzb1 可能在H2O2引起的氧化應激過程中扮演重要角色。見圖3。

圖3 H2O2 對AC16 細胞內Mzb1 表達的影響

2.4 過表達Mzb1 改善AC16 細胞活力

MTT 檢測細胞活力結果顯示，對照組相對細胞活 力 為（100.000±3.420）%，H2O2組 細 胞 相 對 活 力為（29.870±4.129）%，Mzb1+H2O2組相對細胞活力為（73.000±12.860）%；與對照組相比，H2O2引起細胞活力下降（t＝12.380，P＜0.01），與H2O2處理組相比，Mzb1過表達顯著改善由H2O2處理后的細胞活力（t＝3.193，P＜0.05）。見圖4。

圖4 Mzb1 對AC16 細胞活力的影響

2.5 過表達Mzb1 抑制內質網應激

WB 結果顯示，對照組內GRP94 蛋白相對表達量為（1.000±0.000），H2O2組GRP94 相對表達量對為（1.647±0.086），Mzb1+H2O2組GRP94 相對表達量對為（1.056±0.050）；對照組內CHOP 蛋白相對表達量為（1.000±0.000），H2O2組CHOP 相對表達量對為（3.648±0.725），Mzb1+H2O2組CHOP相對表達量對為（2.484±0.273）；與對照組相比，H2O2處理的細胞中GRP94及CHOP表達顯著升高（t＝7.486，P＜0.05；t＝3.654，P＜0.01）；與H2O2組相比，Mzb1 過表達降低了GRP94 及CHOP 的表達水平（t＝7.635，P＜0.05；t＝2.577，P＜0.05）。Mzb1 過表達可以抑制H2O2引起的內質網應激。見圖5。

圖5 Mzb1 對內質網應激相關蛋白表達的影響

2.6 過表達Mzb1 抑制H2O2 引起的細胞凋亡

WB 結果顯示，對照組內活化型的Caspsase3（Cleaved-Caspase3）蛋白相對表達量為（1.000±0.000），H2O2組Cleaved-Caspase3 相對表達量為（2.196±0.237），Mzb1+H2O2組Cleaved-Caspase3 相對表達量為（1.197±0.165）；與對照組相比，在H2O2處理的細胞中，Cleaved-Caspase3 水平升高（t＝5.042，P＜0.05）；過表達Mzb1 后，Cleaved-Caspase3 水平降低（t＝6.886，P＜0.05）。見圖6。

圖6 過表達Mzb1 對細胞凋亡的影響

3 討論

前期研究表明，在急性心肌梗死損傷的組織和心肌細胞中，Mzb1 的表達異常降低，恢復其表達可以降低心肌細胞內ROS 水平，增加腺嘌呤核苷三磷酸（adenosinetriphosphate，ATP）含量，恢復線粒體膜電位，增加細胞耗氧量進而恢復線粒體功能；同時減輕心肌梗死損傷心肌細胞內炎癥，改善心臟功能表明Mzb1 在心肌損傷過程中發(fā)揮保護效應[9]。有研究報道，Mzb1 調節(jié)體液免疫應答與抗體產生的過程，Mzb1 與底物特異性伴侶GRP94 直接作用，參與內質網應激下的免疫球蛋白重鏈（immunoglobulin μ heavy chains，μHCs）生物合成，這表明Mzb1 是GRP94的底物特異性伴侶蛋白，可能在內質網應激途徑中發(fā)揮重要作用[5，11]。因此推斷，Mzb1 可能通過內質網應激途徑影響細胞功能。

氧化應激和缺血會擾亂鈣穩(wěn)態(tài)，誘導錯誤折疊和未折疊蛋白積累，導致內質網應激。內質網應激是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因。以往的研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應和細胞凋亡與心肌梗死損傷密切相關，而內質網應激是誘導炎癥反應和細胞凋亡的重要信號通路。此外，細胞凋亡的特征是染色質濃縮和分離，細胞皺縮，碎裂成凋亡小體，可被巨噬細胞清除[12]。雖然凋亡和壞死的信號通路不同，但它們涉及相同的步驟，如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）的激活[13]。在調控細胞凋亡的信號通路中，與內質網應激相關的凋亡信號已被認為是心肌梗死損傷的重要機制之一[14]。已有文獻表明，在缺血或缺血再灌注后，內質網應激被激活，持續(xù)發(fā)生的內質網應激引起細胞凋亡[15]。內質網應激分子伴侶GRP94 是熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）的同源蛋白，在生理條件下主要介導未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）。它們的表達水平與內質網管理未折疊和錯誤折疊蛋白質的能力相關[16-17]。因此，GRP94 被廣泛認為是內質網應激的標志物。嚴重的缺血缺氧可能導致心肌細胞凋亡增加，心肌梗死后GRP94 表達增加[18]。這些發(fā)現(xiàn)是與實驗數(shù)據(jù)一致，結果顯示H2O2誘導的損傷細胞模型中GRP94 表達增高，而在過表達Mzb1 后GRP94 的表達水平有下降。因此，結果表明Mzb1 的基因表達上調有助于抑制心肌細胞損傷后內質網應激的水平。

此外，Caspase12 位于內質網外膜中，它作為一種主酶發(fā)揮著特殊的作用，參與內質網應激誘導的凋亡通路。與Caspase9 共同作用，反過來激活Caspase3，細胞凋亡執(zhí)行者Caspsase3 屬于半胱氨酸蛋白水解酶家族，其被激活后經剪切分離成活化型的Caspsase3（Cleaved-Caspase3），引發(fā)細胞凋亡。此外，心肌細胞損傷后CHOP 的表達也明顯升高[19]。CHOP 是一種重要的轉錄因子調節(jié)內質網應激誘導的細胞凋亡。CHOP 還可能通過下調Bcl-2 的表達，激活Caspase3，最終導致細胞凋亡[20]。有報道指出，沉默CHOP基因可以減弱內質網應激引起的細胞凋亡[21]。本研究結果顯示，H2O2誘導的損傷細胞模型CHOP 的表達上調，而在過表達Mzb1 后CHOP 的表達水平有下降。這表明Mzb1 過表達可以抑制心肌細胞損傷后內質網應激引起的細胞凋亡。

綜上所述，Mzb1 能改善H2O2引起的心肌細胞損傷，其機制與抑制內質網應激，減少Cleaved-caspase3 的激活，減少心肌細胞凋亡相關。