乳腺癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)及臨床意義

郭毓娟 吳雄 鄭舒靜 陳雅貞

乳腺癌是女性較為常見的惡性腫瘤之一，其是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，已成為僅次于子宮頸癌的第一大惡性腫瘤，嚴(yán)重危害女性患者的生命安全[1]。調(diào)查統(tǒng)計(jì)顯示，2020 年估計(jì)有230 萬新發(fā)病例和68.5 萬死亡病例，并呈現(xiàn)出上升的態(tài)勢(shì)[2]。乳腺癌臨床認(rèn)為遺傳、乳腺良性疾病未經(jīng)治療、更年期、過度飲酒等是其誘因，其早期癥狀不明顯，起病隱匿較強(qiáng)，一旦發(fā)現(xiàn)通常已屬腫瘤的中晚期，導(dǎo)致治療困難，預(yù)后較差[3]。目前，臨床治療乳腺癌有手術(shù)，靶向藥物治療，放、化療等方案，雖然可有效提高患者的生存率，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是患者死亡的重要原因[4]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTC）由澳大利亞籍醫(yī)生Ashworth 于1869 年首次提出，其是指進(jìn)入人體外周血腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱[5]。研究顯示，CTC 在腫瘤的臨床診斷、腫瘤病情轉(zhuǎn)移、療效評(píng)估中發(fā)揮著重要的作用，可有效降低患者的病死率[6]。研究報(bào)道，早期的乳腺癌患者有20%～30%會(huì)出現(xiàn)CTC，并可經(jīng)過血液擴(kuò)散至全身，是導(dǎo)致實(shí)體瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的首要條件[7]。在外周血中檢測(cè)到CTC 提示腫瘤存在轉(zhuǎn)移情況發(fā)生，有進(jìn)一步發(fā)展為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能。因此，CTC 在外周血中的含量對(duì)乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、治療和預(yù)后具有密切的關(guān)系。當(dāng)前，臨床對(duì)于分離CTC 多采用密度梯度離心法、免疫磁珠法、微孔濾膜過濾法、雙向電泳法等[8]。本研究采用納米基底富集分離及免疫熒光染色法檢測(cè)兩組CTC 檢測(cè)陽性率，并就乳腺癌患者外周血中CTC 進(jìn)行檢測(cè)，分析其與臨床病理特征的關(guān)系，為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取福建省漳州市醫(yī)院乳腺外科2020 年12 月—2022年12 月收治的200 例乳腺癌患者納入研究，年齡45 ～60歲，平均（50.22±5.31）歲；全部為女性；其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌170 例，浸潤(rùn)性小葉癌30 例。并選擇同期在福建省漳州市醫(yī)院乳腺外科接受手術(shù)的40 例良性乳腺病進(jìn)行對(duì)照研究，年齡44 ～59 歲，平均（51.34±5.31）歲；全部為女性；乳腺纖維腺瘤25 例，導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤15 例。兩組基線資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者均經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)。（2）就診前未接受任何輔助性治療。（3）無其他部位惡性腫瘤病史。（4）本研究患者知情，并簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）哺乳期乳腺癌者。（2）炎性乳腺癌者。（3）合并嚴(yán)重心肝腎功能不全者。（4）存在其他惡性腫瘤者。（5）處于急性炎癥過程中者。（6）合并糖尿病等基礎(chǔ)性疾病者。本研究通過福建省漳州市醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

采集患者空腹靜脈血3 ～5 mL，防止穿刺部位污染，前3 mL 不用，給予抗凝處理后在血液室溫15 ～30℃時(shí)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CTC 檢測(cè)納米基底制備

將培養(yǎng)皿放置于等離子儀（廣州善準(zhǔn)科技有限公司，型號(hào)：VP-R5），用高功率高能氧等離子體轟擊聚苯乙烯基板，制備均勻的納米結(jié)構(gòu)。用3%的APTES 潤(rùn)洗聚苯乙烯基底，使其覆蓋上正電荷，避光1 h，培養(yǎng)皿放80℃烘箱烘干1 h 備用。

1.2.3 全血處理

采集的靜脈血中注入4 mL 1×的紅細(xì)胞裂解液中，室溫放置10 min，然后離心5 min，以3 000 r/min 去除上清，保留細(xì)胞。向離心管中加入2 mL 1%磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS），然后離心5 min，以3 000 r/min 去除上清。放置于培養(yǎng)皿中，停留50 min。然后向培養(yǎng)皿中加入4%甲醛后置于4℃停留10 min。1 mL 封閉液中注入2 μL 抗泛角蛋白和2 μL 抗-人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，Her2），2 μL 抗-CD11b 熒光標(biāo)記一抗，混勻注入培養(yǎng)皿中，4℃孵化一晚。清除抗體，使用磷酸緩沖鹽溶液清洗3 次，注入4 μL 山羊抗-兔 IgG 二抗，使其充分混勻后注入培養(yǎng)皿中室溫孵化1 h。然后再清除抗體，使用磷酸緩沖鹽溶液清洗3 次，隨后加入1 mL 二脒基苯基吲哚（diamino-2-phenyl indole，DAPI），孵化30 min。清除抗體，使用磷酸緩沖鹽溶液清洗3 次，注入DAPI，再用2 mL 磷酸緩沖鹽溶液清洗3 次，然后再注入1 mL 酸緩沖鹽溶液，放置于4℃保存。

1.2.4 免疫組化及熒光原位雜交檢測(cè)

使用免疫組化檢測(cè)雌激素受體（estrogen receptor，ER）和孕激素受體（progesterone receptor，PR），克隆號(hào)分別為SP1、SP2，上海雅吉生物科技有限公司生產(chǎn)。ER、PE 呈黃色、棕黃色顆粒，位于細(xì)胞核，采用雙人盲法觀察結(jié)果，按照隨機(jī)數(shù)據(jù)計(jì)數(shù)1 000 個(gè)細(xì)胞，選擇10 個(gè)高倍視野，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比，＜10%確定為（-），≥10%確定為ER、PE（+）。如若結(jié)果雙人出現(xiàn)5%的偏差則重新評(píng)估。采用（益善生物技術(shù)股份有限公司，國械注準(zhǔn)20163400777）Her2 基因擴(kuò)增試劑進(jìn)行檢查，檢查步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。按照隨機(jī)在熒光顯微鏡下選取20 個(gè)浸潤(rùn)性乳腺癌細(xì)胞核進(jìn)行檢查，按照2014 版中國乳腺癌Her2 檢測(cè)指南。Her2 陽性標(biāo)準(zhǔn)：Her2/探 針 拷 貝 數(shù)CEP17（17p11.1-q11.1）＜2.0 或Her2/CEP17 ≥2.0，平均Her2 拷貝數(shù)/細(xì)胞≥6，為Her2 陽性。

1.2.5 CTC 的鑒定方法

采用高分辨掃描儀購于（武漢光量科技有限公司，型號(hào)：BFI Plus）進(jìn)行多色成像分析，選擇異硫氰酸熒光素酯（fluorescein isothiocyanate isomer，F(xiàn)ITC）、磺基菁5（sulfocyanine 5，CY5）、DAPI 通道。綠色為Her2（+）、藍(lán)色為DAPI（+）、橙色為CD11b（+）、紅色為CK（+），當(dāng)DAPI（+）/CK（+）/CD11b（-）且呈現(xiàn)出完整的細(xì)胞形態(tài)則表示為CTC。若是DAPI（+）/CK（+）/Her2（+）/CD11b（-）則表示是Her2（+） CTC。操作人員觀察表面熒光顏色，檢測(cè)到1 個(gè)或以上的CTC 即為陽性。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組CTC 檢測(cè)陽性率，分析CTC 與年齡、腫瘤大?。═ 分期T1、T2、T3）、病理類型（浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、浸潤(rùn)性小葉癌）、血管侵犯、ER 和PR、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征相關(guān)性，并分析CTC Her2 表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，一致性比較采用Kappa 一致性檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CTC 陽性檢測(cè)情況比較

200 例 乳 腺 癌 組 織 中，CTC 陽 性130 例， 占 比65.00%；CTC 陰性70 例，占比35.00%；40 例乳腺良性組織未檢測(cè)到CTC，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝19.765，P＜0.05）。

2.2 乳腺癌患者CTC 與臨床病理特征的關(guān)系

乳腺癌患者陽性檢測(cè)與血管侵犯有關(guān)（P＜0.05）；而與年齡、腫瘤大小、病理類型、ER、PR、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均無相關(guān)（P＞0.05）。見表1。

表1 乳腺癌患者CTC 與臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 乳腺癌患者外周血CTC Her2 陽性檢測(cè)率比較

130 例CTC 陽性乳腺癌患者有95 例乳腺癌組織檢測(cè)到Her2 陽性。本次結(jié)果在外周血檢查出CTC 存在Her2 陽性有80 例，陰性有15 例，經(jīng)Kappa 一致性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Kappa值為0.812（P＜0.05）。見表2。

表2 乳腺癌患者外周血CTC Her2 陽性檢測(cè)率比較[例（%）]

3 討論

乳腺癌是危害女性身體健康的惡性腫瘤，臨床表現(xiàn)為乳房疼痛、腫塊。研究顯示，我國每年發(fā)病率超過50 萬例，并呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[9]。乳腺癌早期缺乏明顯癥狀，確診時(shí)大多已發(fā)生為中晚期，預(yù)后較差。在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的因素很多[10]。CTC 是指自發(fā)或因診療操作或腫瘤在形成發(fā)展中原發(fā)病變部位脫落或轉(zhuǎn)移，從而進(jìn)入到外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞統(tǒng)稱[11]。CTC 作為液體活檢的一種生物標(biāo)志物，其具有反映腫瘤負(fù)荷，腫瘤轉(zhuǎn)移病灶的潛力，在臨床實(shí)踐中得到了廣泛的應(yīng)用，是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中重要標(biāo)志物[12]。研究報(bào)道，治療過程中檢測(cè)CTC 水平，能夠?yàn)橹委煼桨柑峁┮欢ǖ膮⒖糩13]。但CTC 在血液中含量極其稀少，基因表達(dá)不穩(wěn)定的特點(diǎn)，每10 mL 血液中可能只含有幾個(gè)、幾十至上百個(gè)CTC，但它有上億個(gè)紅細(xì)胞與白細(xì)胞。因此，尋找有效的檢測(cè)方法尤為重要。

研究顯示，納米基底富集分離及免疫熒光原位雜交技術(shù)的檢測(cè)能夠提高CTC 檢測(cè)的敏感性和特異性[14]。本研究結(jié)果顯示，200 例乳腺癌組織中，CTC 陽性130 例，占比65.00%；40 例乳腺良性組織未檢測(cè)到CTC，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；乳腺癌患者陽性檢測(cè)與血管侵犯有關(guān)（P＜0.05）；而與年齡、腫瘤大小、病理類型、ER、PR、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均無相關(guān)（P＞0.05）。分析原因，實(shí)體腫瘤的部分腫瘤細(xì)胞存在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）和間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymal epithelial transformation，MET）功能。腫瘤細(xì)胞利用原發(fā)部位的EMT 作用侵入附近血管，從而在血液中循環(huán)。CTC 在血流的剪切力下死亡，只有少數(shù)具有高活性和轉(zhuǎn)移潛力的腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中存活[15-16]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者外周血中CTC 陽性與血管侵犯相關(guān)。瘤細(xì)胞能夠分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，從而促使腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞本身進(jìn)入血管與血液成分聚合，從而形成癌栓[17]。研究顯示，外周血檢出CTC 能夠預(yù)測(cè)乳腺癌早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，是一種預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，可為臨床治療提供依據(jù)[18]。并發(fā)現(xiàn)治療后CTC 的存在與患者的無進(jìn)展生存期及總生存期密切相關(guān)；CTC 數(shù)目越多，表示生存期越短。因此，外周血CTC 檢測(cè)能夠動(dòng)態(tài)地觀察乳腺癌患者病情變化，為其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的概率做出及時(shí)判斷，也可對(duì)治療方案提供一定的依據(jù)。Her2 作為乳腺癌重要的治療靶點(diǎn)，其表達(dá)與乳腺癌的侵襲存在關(guān)系，是乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要高危因素之一[19]。本研究結(jié)果顯示，130 例CTC 陽性檢查出95 例Her2 陽性。外周血檢查出CTC 存在Her2 陽性有80 例，兩者比較一致性為84.21%（80/95）。與李剛強(qiáng)等[20]結(jié)果相一致。由此表明CTC 表面分子標(biāo)志物可以反映實(shí)體腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，檢測(cè)CTC 中Her2 能夠?yàn)榘邢蛩幬镏委熖峁┮欢ǖ囊罁?jù)。但有相關(guān)研究報(bào)道認(rèn)為，CTC 的Her2 表達(dá)在細(xì)胞分裂過程中是可變的，在Her2 陰性乳腺癌體內(nèi)也可檢出Her2 陽性的CTC，Her2陽性的CTC 可能也會(huì)分裂出Her2 陰性的CTC[21]。CTC源于腫瘤的一個(gè)亞群，存在較高的惡性潛能，其表型與組織存在差異，這可能是部分Her2 陽性患者對(duì)抗腫瘤藥物治療效果不佳的原因之一，可能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)CTC 中Her2表達(dá)對(duì)靶向藥治療具有重要的作用。同時(shí)，此文的研究結(jié)果為乳腺癌患者診治標(biāo)準(zhǔn)制定提供了借鑒內(nèi)容。

綜上所述，乳腺癌患者外周血CTC 的表達(dá)可用于評(píng)估其病情，CTC Her2 檢測(cè)可能有助實(shí)時(shí)判斷Her2 的狀態(tài)，對(duì)乳腺癌患者的預(yù)后有一定價(jià)值。