針灸治療血管性癡呆的實驗研究進展*

李玉秋,羅本華,凌艷君

廣西中醫藥大學針灸推拿學院,廣西 南寧 530000

血管性癡呆(vascular dementia,VD)常繼發于腦動脈粥樣硬化或腦卒中后,是由缺血性腦血管疾病引起的認知功能障礙綜合征,臨床表現為記憶或認知功能受損,伴運動、語言、視空間、人格障礙等[1-2]。隨著社會人口老齡化和腦卒中存活率的提高,VD發病率逐年升高,患者會出現嚴重的記憶和認知功能缺損,不僅影響生活質量,而且造成了巨大的社會和家庭負擔[3-4]。VD是可以早期預防并有治愈可能的癡呆類疾病,已經成為癡呆研究領域的重點之一,但由于療效不明確及不良反應較多,目前世界范圍內尚沒有藥物化合物被批準用于VD的治療[5-6]。近年來,大量研究發現針灸能夠多靶點、多途徑改善VD患者認知障礙,為有效且相對安全的治療方法[7-8]。現將近年針灸治療VD的相關實驗研究進展綜述如下。

1 改善神經行為學

VD動物模型的療效評價主要是通過神經行為學的改變進行判定,目前多采用水迷宮、Y-型迷宮、穿梭箱實驗、跳臺實驗等評分方法,側重于客觀評估動物學習、記憶等行為的改變。朱鈺等[9]采取雙側頸總動脈永久性結扎法制作大鼠VD模型,運用Morris水迷宮實驗進行行為學測試,發現與模型組大鼠比較,經“調心通督”針刺法(斜刺水溝、神庭、百會、風府、大椎、命門穴,直刺大陵、勞宮、內關穴)干預的VD大鼠,穿越原平臺次數增加,平均逃避潛伏期縮短,學習記憶能力得到明顯改善。桂利[10]以“化瘀通絡”灸療法(每日灸“大椎”“百會”“神庭”穴20 min)治療VD模型大鼠3周后,受試的各組大鼠進行每日4次、每兩次訓練之間間隔至少10 min的水迷宮訓練,并于第5日進行空間探索測驗,最終發現艾灸組的成績明顯優于模型組,“化瘀通絡”灸療法具有與西藥鼠神經生長因子相同的療效。鞠慶波等[11]采用Y-型迷宮檢測眼針(眼針肝區、心區、腎區)對VD大鼠的記憶能力進行測試,每天記錄大鼠跑向迷宮安全通道按下箱頂信號燈的時間,發現眼針組大鼠Y-迷宮箱成績明顯優于模型組。陳晶等[12]選用“風池”“供血”兩個經驗要穴,通過電針接入刺激干預模型VD大鼠,以Y-型迷宮檢測學習記憶能力,發現大鼠Y迷宮學習與記憶的正確次數顯著提高。馬莉等[13]采用額區電針法干預VD大鼠,以穿梭箱實驗測評大鼠行為學變化,結果顯示,治療后VD大鼠電擊次數與電擊時間明顯縮短,證實認知學習能力有所提升;西藥組與電針組相比,差異無統計學意義,說明針刺在改善大鼠行為學方面具有與西藥腦復康水同等的改善效果。李巖等[14]采用“醒神開竅”針刺法進行干預,發現針刺大鼠在穿梭箱實驗中遭受電擊次數、電擊時間、主動回避次數的成績顯著優于模型大鼠。楊春壯等[15]予VD大鼠針刺百會、大椎、人中穴治療,30 d后,通過大鼠跳臺實驗檢測VD大鼠的行為學,發現針灸組大鼠跳臺檢測反應期(即大鼠跳到安全臺躲避電擊的時間)較模型組明顯縮短,提示針灸對大鼠的認知行為有改善作用。喬曉迪等[16]選取跳臺實驗動態觀察耳針對VD大鼠行為學的影響,取“心”“腎”“皮質下”等耳部穴位,分別以治療后30 d和60 d后作為測試時間點,結果發現經耳針治療的大鼠跳臺潛伏期均顯著增加,跳臺錯誤次數均減少,證明耳針對VD大鼠的認知障礙具有明顯的改善作用。

2 抑制神經細胞凋亡

一定的外界生理或病理條件會誘發細胞產生凋亡刺激信號,此時基因自主控制細胞為了保持內環境穩定而進行的自主性死亡過程為細胞凋亡[17-18]。研究發現,神經細胞凋亡是大腦缺血后引發腦神經元損傷的一種機制[19-20]。腦部缺血再灌注會引起細胞凋亡,細胞凋亡的加重又促進了VD的發生[21]。凋亡過程需多種蛋白質參與,以B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)兩大家族為主,這兩大家族能較好地接收、傳導和擴大細胞內外的凋亡信號[22-23]。研究表明,針灸可通過調節這兩類蛋白的表達抑制神經元凋亡,改善記憶能力[24]。鹿俊磊等[25]采用免疫組化染色法檢測VD大鼠海馬組織,發現頭穴叢刺的干預可上調抗凋亡基因Bcl-2,下調促凋亡基因Bax、凋亡執行蛋白酶caspase-3陽性細胞,并進行動物行為學學習記憶能力測試,推測頭穴叢刺改善VD學習記憶能力與抑制細胞凋亡相關。郭菲等[26]觀察電針干預(大椎、百會、后三里、膈俞)對VD大鼠海馬組織相關蛋白表達的影響,結果顯示,電針可顯著降低凋亡執行啟動蛋白酶caspase-8、執行蛋白酶caspase-3表達,及下調 c-Jun 氨基末端蛋白激酶(c-Jun NH2-terminalprotein kinase,JNK)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)蛋白表達(caspase凋亡級聯反應激活蛋白),從而抑制腦缺血再灌注對海馬神經元造成的損傷。朱雯等[27]于造模后采用針刺足三里、百會穴進行干預,應用免疫熒光法、尼氏染色法(Nissl staining)、TUNEL法分別觀察VD大鼠皮質的p-JNK 表達、神經元形態學改變、神經元凋亡情況,發現針刺治療可抑制VD模型大鼠皮質p-JNK 的表達,改善神經元細胞核固縮、深染情況,減少細胞凋亡數量。張鑫等[28]采用通督調神針刺療法(穴選“百會”“大椎”“脾俞”“腎俞”)干預,以Morris水迷宮檢測空間學習記憶能力后,分離各組大鼠海馬組織,觀察各組大鼠海馬的細胞凋亡數量及促凋亡蛋白磷酸酶和張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)表達,結果發現,經通督調神針刺療法干預的VD模型大鼠細胞凋亡數量及促凋亡蛋白 PTEN表達顯著降低,學習記憶能力明顯改善。陳英華等[29]運用四血管阻斷法制作VD大鼠模型,對模型大鼠分別進行手針及電針治療后,采用免疫組化法檢測海馬組織,發現不論是手針組還是電針組(均選用神聰穴、風池穴干預),均能有效抑制腦組織細胞凋亡相關蛋白caspase-3、NF-κB p65及PTEN mRNA表達,提示針刺對腦缺血再灌注具有腦保護作用。

3 調節神經遞質

腦中常見的神經遞質有膽堿類、單胺類、氨基酸類等,這些神經遞質系統參與大腦的學習、記憶功能,是中樞神經系統的重要組成部分,研究發現這些神經遞質的異常代謝不同程度地參與了VD的病理過程[30-31]。李新華等[32]在采用兩血管阻斷加硝普鈉降壓法造模后,通過對比西藥尼莫同組,觀察交通任督法(針刺“風府”“百會”“人中”“關元”)對VD大鼠學習記憶功能及海馬乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)活性的影響,證實交通任督針法可明顯改善VD大鼠海馬組織的AChE含量異常減少現象,增強學習記憶能力。楊曉波等[33]采用反復夾閉雙側頸總動脈-再灌注法復制VD大鼠模型后,觀察溫通針法對其海馬煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)亞單位蛋白表達水平的影響,發現溫通針法可通過上調VD大鼠海馬nAChR表達來改善學習記憶能力。董娟等[34]以交通任督針法干預VD大鼠,發現干預大鼠與模型組比較,海馬組織的5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)含量明顯提高,差異具有統計學意義,從而得出交通任督法針刺對VD大鼠海馬單胺類遞質的代謝紊亂及認知障礙具有改善作用的結論。楊俊麗等[35]以頭穴叢刺長留針法為治療方法,取大鼠的額區、頂前區、頂區,留針6 h,治療4周后,發現VD大鼠海馬組織ACh含量明顯增多,多巴胺(dopamine,DA)、5-HT含量升高,頭穴叢刺可調節記憶相關的神經遞質的釋放,減輕神經元受損程度。張秀景[36]發現,采用電針刺激“大椎”“百會”“膈俞”“后三里”穴可以明顯增加VD模型小鼠海馬組織的單胺類神經遞質去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)、DA和5-HT含量。仲秀艷等[37]觀察電針針刺腎俞、膈俞、百會穴對VD大鼠海馬谷氨酸 (glutamate,Glu)、γ-氨基丁酸(γ-AminobutyricAcid,GABA)含量的影響,用氨基酸自動分析儀檢測,結果發現,電針可顯著升高VD大鼠海馬的抑制性氨基酸GABA含量,降低海馬組織興奮性氨基酸Glu含量,對大鼠的學習記憶能力有改善作用。張茜等[38]采用電針(百會、大椎、膈俞、后三里)干預VD模型大鼠,并檢測大鼠海馬組織中的Glu含量和N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)蛋白表達量,結果發現,電針組Glu含量及NMDAR表達量較模型組明顯降低,提示電針治療可通過抑制Glu-NMDAR的神經興奮毒性,對抗神經細胞損傷。

4 減輕氧化應激損傷

腦部慢性缺氧缺血是VD重要的病理學基礎,缺氧缺血可引發腦組織氧化應激反應,造成大腦神經元損傷,從而導致認知障礙[39-40]。腦缺血期間產生的過量氧自由基會攻擊細胞生物膜,導致血腦屏障被破壞,血管內皮與血小板黏附功能增強,腦組織的微循環障礙加重,同時也造成腦細胞內氧化磷酸化的失調,使神經功能受損[41-42]。人體抗氧化防御系統主要分為抗氧化酶(超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等)和抗氧化劑(維生素C、維生素E、輔酶Q、谷胱甘肽等);人體內主要的自由基有活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)、一氧化氮(nitric oxide,NO)[43-44];氧化應激反應的代謝產物主要有丙二醛(malonaldehyde,MDA),可反映自由基導致細胞損傷的程度[45]。姬軍風等[46]造模后選用百會、膈俞、膻中、氣海、三陰交穴(益氣活血方)治療VD大鼠,發現針刺可提高大鼠的學習記憶能力,降低海馬組織中MDA水平,升高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,具有清除自由基的作用。姜孝德[47]從抗氧化機制角度探討“嗅三針”對VD模型大鼠的作用機理,通過檢測大鼠血清中谷胱甘肽(glutathione,r-glutamyl cysteingl glycine,GSH)、SOD、MDA的含量,發現“嗅三針”(印堂穴、兩側迎香穴)能明顯提高GSH含量及SOD活性,顯著降低MDA含量,從而強化VD大鼠的抗氧化機制。孫彥輝等[48]在完成缺血再灌注VD小鼠模型復制后,予“百會”“大椎”“膈俞”“足三里”進行電針刺激,干預結束后,觀察海馬SOD活性,發現造模當日和造模第3天電針組小鼠SOD活性均明顯增強,一氧化氮合酶(NO synthetase,NOS)、MDA含量均明顯降低,且造模第3天電針組改善明顯優于造模當天。杜斯琪等[49]通過DHE染色檢測ROS含量,通過黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性,發現與模型組大鼠比較,針刺百會、雙側足三里后,VD大鼠前額葉皮層SOD活性明顯升高,ROS含量顯著降低,推斷針刺可抑制VD大鼠前額葉皮層的氧化應激水平。武澤惠等[50]觀察不同頻率電針對VD模型小鼠海馬組織自由基影響的差異性:選取百會、大椎、膈俞及足三里穴,毫針刺入后接電針儀,分別以不同頻率干預,采用硫代巴比妥酸比色法測定MDA含量,分光光度法測定NOS活性,黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性,結果發現電針干預后的小鼠海馬組織MDA含量明顯降低,NOS活性降低,SOD活性提高,提示不同頻率的電針治療均可對抗VD大鼠脂質過氧化損傷,以疏密波2 Hz/80 Hz的干預效果最突出。

5 營養神經,促進神經、血管再生

腦缺血后,腦內血液供應不足,許多研究者以挽救瀕臨死亡的細胞、神經膠質細胞和血管內皮細胞為重點方向,各種刺激腦內毛細血管生成的干預措施成為治療VD的新手段。腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)作為腦部營養性質因子,可激活多種胞內信號,從而刺激受損神經元修復,促進神經細胞再生與增殖,延長神經細胞存活時間[51-52]。劉佩等[53]以BDNF為檢測指標,觀察不同時相電針治療(百會、大椎穴)后VD大鼠海馬BDNF mRNA表達的變化規律,結果提示電針可提高海馬BDNF mRNA的含量,且其表達隨著治療時間的延長而增加。田玥等[54]以鹽酸多奈哌齊為對照,探討通督醒神針法(百會、神庭、人中穴)對VD模型大鼠海馬神經再生的影響,用免疫組化法檢測BDNF與其酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)的蛋白表達,發現該針法能顯著上調VD大鼠BDNF與TrkB的蛋白表達水平,具有促進神經細胞再生的功能。張媛媛等[55]觀察VD大鼠BDNF、TrkB表達水平與化瘀通絡灸的關系,懸灸百會、大椎、神庭穴,每穴20 min,每天治療1次,14 d為1個療程,并將艾灸組按療程分組,采用免疫熒光實驗觀察各組BDNF、TrkB表達水平,結果發現化瘀通絡灸可上調BDNF及TrkB蛋白的表達,且蛋白表達隨療程的增加而逐步增加。梁慧英等[56]對大鼠海馬組織BDNF與突觸后致密蛋白-95的蛋白表達影響進行免疫印跡檢測,發現采用電針百會、足三里穴治療的大鼠海馬組織中BDNF蛋白質表達均顯著增加,推測電針對VD大鼠記憶力的改善可能與BDNF表達增加相關。樊吟秋等[57]觀察灸法與VD大鼠神經血管新生的關系,結果發現懸灸百會、大椎和神庭穴可提高模型大鼠海馬巢蛋白(nestin)、雙皮質素(doublecortin,DCX)和CD34等神經新生及血管再生重要因子蛋白的表達,提示艾灸有助于海馬的神經新生和血管生成,改善VD記憶缺陷。王頻等[58]對VD大鼠百會穴使用隔附子餅灸,神庭、大椎穴用清艾條懸灸,結果發現VD大鼠海馬內促腦血管新生的關鍵因子血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達顯著上調,提示該法可促進要害部位的血管生成。高音來等[59]以海馬組織VEGF、血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)蛋白表達為切入點,在成功造模后,采用“調心通督”針法(穴選百會、神庭、水溝、大椎、風府、命門、內關、大陵、勞宮穴)對VD大鼠進行針刺干預,結果提示“調心通督”針刺法能明顯上調海馬組織VEGF、Ang-1蛋白表達,誘導血管新生,改善VD癥狀。張曼等[60]采用化瘀通絡灸治療VD模型大鼠,將大鼠剃毛固定后分別于百會、神庭、大椎穴位隔上附子餅,并以清艾條壓灸,療程結束后以大鼠血清VEGF、堿性成纖維細胞生長因子作為干預的觀察對象,結果發現化瘀通絡灸可以顯著增強VEGF和堿性成纖維細胞生長因子的蛋白表達。馬莉等[61]在頭穴叢刺基礎上加用電針治療VD大鼠,選用額區的前庭、囟會等穴位,發現電針組大鼠的血清VEGF含量明顯高于模型組,并于光鏡下觀察到電針組大鼠海馬凋亡細胞顯著減少,推測針灸可通過調節血清VEGF含量從而促進腦血管再生,抑制細胞凋亡,改善臨床癥狀。

6 減輕炎癥反應

由慢性腦缺血引起的腦組織炎癥反應與缺血后的繼發性大腦神經元損傷密切相關[62]。當腦部發生缺血后,局部內皮細胞、神經元等被激活,釋放白細胞介素-lβ(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等炎性因子,進一步刺激其他炎性因子的釋放,并誘導炎癥細胞進入損傷的腦組織,引發炎癥級聯反應,造成神經元損傷,導致認知障礙[63-64]。黃琳娜等[65]應用頭皮針針刺VD大鼠,頭針組選頭部“倒臟上焦(雙側)、記憶(雙側)、信號(雙側)、思維”穴,經2個療程治療后,發現頭皮針可減少VD大鼠大腦海馬組織中 IL-6 含量,對VD大鼠神經具有保護作用。曹燕[66]對VD模型大鼠予針刺“百會”穴及雙側“足三里”穴治療后,采用ELISA技術檢測海馬促炎因子 IL-6 和TNF-α含量,結果顯示干預組海馬促炎因子 IL-6 和TNF-α含量降低,mRNA表達水平顯著下降,提示針刺有抑制神經炎癥的作用。房雅楠等[67]選取完骨穴為電針針刺穴位,探討針灸作用于VD的機制,發現電針完骨穴可以顯著降低VD大鼠海馬組織炎性細胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β mRNA的表達,從而推測針灸可通過抑制海馬炎性因子的過度產生來修復受損神經,改善VD記憶障礙。田文靜等[68]以頭針治療VD模型大鼠,并用酶聯免疫吸附法檢測到治療組大鼠海馬組織中炎性介質TNF-α含量顯著低于模型組。楊靜雯等[69]以雙血管阻斷法建立的VD大鼠模型為研究對象,觀察各組大腦前額葉皮層炎癥調節因子Toll樣受體4(Toll-like receptor4,TLR4)表達及下游炎癥因子 IL-1β、IL-6的mRNA表達,發現針刺“足三里”“百會”可降低VD大鼠大腦前額葉皮層炎癥調節因子TLR4、IL-1β、IL-6的含量,改善學習記憶能力。阮靜茹等[70]通過懸灸“關元”“命門”“大椎”穴探討艾灸對VD大鼠炎性因子的影響,發現經艾灸治療后,VD大鼠海馬組織中促炎因子TNF-α、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)p65、IL-6、IL-1β表達明顯下降,推測艾灸干預抑制了VD大鼠促炎因子表達,能夠減輕腦缺血后的炎性反應性損傷,進而改善認知功能。

7 討論

近年來,隨著心腦血管疾病發病率顯著提高,VD的防治已成為醫學界亟須解決的難題,而針灸對于VD患者顯著的臨床療效推動了相關動物實驗的深入開展。研究發現,針灸能夠通過改善VD動物模型的神經行為學、神經細胞凋亡、神經遞質異常、氧化應激、炎癥損傷及神經血管損傷等途徑減輕VD認知障礙,療效顯著,應用前景廣闊。但目前研究仍存在一定的不足:(1)在動物模型復制方面,VD造模方法多樣,但多數實驗采用雙側頸總動脈結扎法及雙側頸總動脈加椎動脈阻斷法,這兩種造模方法存在動物病死率高、操作難度大的缺點,適用于全腦缺血的慢性低灌注型VD,但不適用于臨床常見的VD分型,即多發梗死性癡呆,導致可信度差;部分實驗采用的血管栓塞法具有與多發梗死的病理損害高度相似的特點,也存在造模難度大以及對操作者要求較高的問題;(2)研究多通過水迷宮、Y迷宮、穿梭箱實驗、跳臺實驗等行為學評分方法對動物認知水平進行測評,儀器設備不統一,且評分判斷多受實驗者主觀因素的影響,客觀性不足;(3)機制研究存在局限性,如腦神經元功能、血管病理形態、基因信號通路方面的研究少見報道,研究指標、靶點單一;(4)多數實驗研究樣本量不足、設計欠嚴謹,造模后未進一步采用行為學或影像學檢測篩選模型,可能會有個別動物模型不符合癡呆標準,降低結果的可信度。故今后的實驗研究可從以下幾方面入手:(1)探索更具有代表性、操作更為簡單的模型復制方法,提高動物存活率,降低造模對操作者熟練程度的依賴性;(2)挖掘更具客觀性的動物認知能力評價標準,盡可能減少實驗者主觀因素的影響;(3)加強腦神經元功能學、信號轉導及血管病理形態等方面的機制研究;(4)規范實驗設計,提高樣本量,造模后利用行為學檢測或影像學技術剔除不符合標準的動物模型,為干預方法的可行性提供客觀嚴謹的證據。總之,加強動物實驗研究的廣度、深度,為針灸治療VD提供更加充分、科學的實驗依據,是推廣針灸臨床應用、提高VD患者生活質量的重要途徑。