中醫藥促進股骨頭壞死血管修復與生成的研究進展*

劉子嘉,李瑩,高利珍,姚耀,張沛剛,王波文,曹玉舉,2

1.河南中醫藥大學,河南 鄭州 450046; 2.鄭州中醫骨傷病醫院,河南 鄭州 450016

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是骨科常見疑難病,后期致殘率較高。據統計,中國15歲以上的非創傷性ONFH患者約812萬,患病率持續增長[1],已成為備受關注的公共衛生問題。ONFH的發病可能與骨內高壓、脂肪栓塞、骨內血管損害等有關,其發病機制尚未明確,但病理基礎研究認為,初期為血液循環不暢,末期是血供難以維持骨組織需要,周圍骨細胞、骨髓造血干細胞等發生不同程度的死亡,最終發生ONFH[2]。有學者指出,血管完整性在ONFH的自我修復中具有重要作用,可為受損骨組織提供充分的營養支持,因此,調控相關信號通路促進血管修復、生成,在早期截斷ONFH病情的進展有其必要性[3]。當前研究認為,ONFH血管修復與生成主要涉及磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)/蘇氨酸激酶(threonine kinase,AKT)通路、Notch通路、缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)通路、微小RNA(microRNA,miRNA)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、骨形成發生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)、炎癥因子等途徑。近年來,國家大力支持中醫藥發展,中醫藥療效也逐漸被大眾認可,中醫藥預防及早期治療ONFH效果顯著,不良反應發生率低[4]。當前研究發現,中醫藥可通過調控以上途徑促進血管修復與生成,延緩ONFH病情進展,現將中醫藥促進ONFH血管修復與生成的研究進展綜述如下。

1 中醫藥通過調控相關信號通路促進血管修復與生成

1.1 PI3K/Akt信號通路PI3K作為一組信號傳導酶,被外界因素刺激后,磷脂酰肌醇肌醇環上的 3′-OH發生磷酸化改變,繼而激活下游靶點發揮作用。AKT作為PI3K的直接靶蛋白,在PI3K的調節下,AKT本身及其下游多種激酶均會被激活,既往研究證實,PI3K/AKT通路在調控骨細胞增殖分化、凋亡等方面具有重要作用[5]。骨微血管內皮細胞(bone microvascular endothelial cells,BMECs)作為股骨頭重要血供結構,對維護血管功能、保障骨組織血供非常重要,有學者認為,PI3K/AKT通路與BMECs的增殖分化、遷移、凋亡等過程密切相關[6]。過度使用糖皮質激素(glucocorticoids,GCs)會激活PI3K/AKT通路,抑制BMECs活力,引起骨代謝紊亂或骨細胞凋亡,而使用PI3K抑制劑則會減輕GCs的有害作用[7]。在股骨頭組織缺血缺氧時,PI3K/AKT通路也會被激活,釋放出大量血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和HIF-1α等,誘導BMECs增殖分化,改善組織缺血缺氧,并促進ONFH壞死組織處的血管修復,阻止病情進展[8]。近期研究發現,PI3K/AKT通路與BMSCs分泌的細胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)具有相關性,BMSCs-EV能通過PI3K/AKT通路調節BMECs自噬,影響其生物學功能[9],并且認為細胞自噬能誘導BMSCs分化為VEGF,促進血管修復與生成[10],改善ONFH的臨床癥狀。綜上,PI3K/AKT通路能夠影響骨細胞增殖分化、促進血管修復、生成主要與BMECs有關,而且在ONFH發病初期,該通路會被激活,完成機體自我修復,具有正向的調節作用。

骨碎補提取物能通過激活PI3K/AKT通路增加VEGF、Runx-2、骨保護素、骨鈣素等蛋白表達,促進血管修復,同時降低破骨細胞分化因子表達,抑制骨細胞凋亡,阻止激素性股骨頭壞死(steroid induced osteonecrosis of the femoral head,SONFH)病情進展[5]。銀杏葉提取物能通過PI3K/AKT通路改善SONFH骨組織中BMECs的凋亡和功能障礙,逆轉GCs引起的血管生成抑制,提高PI3K、AKT、內皮型一氧化氮合酶等蛋白表達,并且發現隨著銀杏葉提取物劑量的增加,空骨陷窩率明顯降低,能夠延緩SONFH病情進展[6]。健脾活骨方能通過激活PI3K/AKT通路提高人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial Cells,HUVECs)中PI3K、p-Akt、細胞外信號調節激酶、c-Jun氨基端激酶等蛋白表達,同時隨著該藥物劑量升高,HUVECs遷移、增殖和血管腔形成能力也隨之增強,認為該藥物可以通過激活PI3K/AKT通路干預GCs引起的 HUVECs 損傷[11]。

1.2 Notch信號通路Notch通路是哺乳動物體內存在的一條高度保守的信號通路,可以調控BMSCs的增殖和成骨分化,同時促進骨修復。Notch通路促進血管修復與生成是當前研究熱點之一,有研究發現,當阻斷機體H亞型血管內Notch通路后,不僅會發生軟骨缺損、骨小梁減少等成骨低下現象,還會損害血管的生長形態,而激活Notch通路后,H亞型血管內BMECs開始增殖分化,分泌高表達的Noggin蛋白,從而促進軟骨細胞分泌VEGF,引導血管出芽,形成成血管-成骨耦連,促進血管再生、骨重建等[12]。Jag1作為Notch通路轉錄過程中的受體蛋白,廣泛存在于內皮細胞中,當Jag1受體蛋白缺失時,血管發生重塑缺陷,內皮細胞不能形成良好的網狀結構,BMECs遷移能力下降,Jag1蛋白表達增加,可以促進內皮細胞出芽[13]。Notch通路的配體蛋白DLL4激活Notch通路后,能防止內皮細胞過度出芽,同時又保證骨組織處有新生血管形成,使血管功能重塑[14],認為當該通路的受體及配體蛋白表達時,該通路也會被激活而產生作用。此外,Notch通路與Wnt/β-catenin通路之間可以相互作用,并誘導VEGF、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)等表達,促進造血祖細胞增殖分化為血管,為骨壞死組織提供營養支撐[15]。從以上可以了解到Notch通路作為一個正向調節通路,不僅本身會促進骨細胞、血管生長,而且其所屬配體、受體蛋白也會在該通路作用下調節血管的修復與生成。

骨碎補總黃酮能通過激活Notch通路上調Notch1、Hes1等蛋白表達,促進VEGF、BMP-2等蛋白生成,構成成血管-成骨耦聯,抑制ONFH的病情進展[16]。單獨使用補腎活血方可以改善SONFH模型大鼠的臨床癥狀,大鼠骨組織內血管生成增加,空腔率、脂肪組織面積下降,大鼠血清中Jag1、Notch1等蛋白表達顯著降低,而在補腎活血方基礎上添加Jag1/Fc融合片段后,補腎活血方的治療作用被抑制,以上各項指標均被逆轉,認為該藥可以通過抑制DLL4/Notch通路對SONFH起到修復作用[14]。有學者認為,SONFH的發病和Notch3蛋白呈正相關,與PDGF、BMP-2蛋白呈負相關,活血通絡湯可以抑制Notch3蛋白表達,上調PDGF、BMP-2蛋白表達,刺激SONFH血管活性增加,改善壞死組織處血供,同時誘導BMSCs成骨分化,促進骨修復[17]。

1.3 HIF-1α信號通路作為低氧反應通路,HIF-1α 對氧濃度極其敏感,在正常氧飽和濃度下難以檢測出,而在低氧濃度下高表達[18]。研究發現,過度使用GCs可導致機體骨微小血管回流受阻及髓內壓增高,誘導引起血液高黏滯綜合征,OB缺血缺氧,最終形成SONFH[7]。此時,HIF-1α處于較高表達狀態,隨著OB缺氧情況的改善,HIF-1α表達也逐漸下降[19]。多數學者一致認為血管的完整性是骨組織修復的必需條件,而在缺血缺氧環境下,HIF-1α具有促進血管修復與生成的能力[20],VEGF在此過程中起著核心作用[21]。VEGF為 HIF-1α 通路下游靶點,HIF-1α在缺氧環境下可誘導VEGF表達,影響血管生成,亦可調節OB對低氧的適應,促進H型血管生長[20]。另有研究表明,HIF-1α的表達被抑制時,Notch通路的Jag2配體表達也隨之下降,認為HIF-1α可以通過Jag2配體調控Notch通路,促進血管組織出芽[22]。在一項體內研究中發現,對BMSCs進行缺氧預處理后,其細胞凋亡數減少、骨增殖分化能力增強。此外,對其進行免疫學評估,發現細胞內HIF-1α和β-catenin表達均增加,VEGF、堿性磷酸酶、骨鈣素等也隨之增加,且有新生血管狀結構形成,認為在缺氧環境下,機體可通過調節HIF-1/β-catenin通路刺激 BMSCs 分化為血管,增加骨活性[23],有助于ONFH早期治療。近期研究發現,前列腺素E2在血管生成和骨骼修復中有重要作用,能夠增強HIF-1α在常氧環境下的表達,當前列腺素E2介導的HIF-1α表達下調時,則會抑制OB增殖和血管生成[24]。綜上,HIF-1α通路促進血管修復及生成與VEGF、Notch通路及其相關配體Jag2、前列腺素E2等關系密切,在缺血缺氧條件下發揮著正向調節的作用。

研究發現,SONFH患者口服自擬方生脈成骨膠囊后,血清中VEGF、HIF-1α、Toll樣受體4(Toll-likereceptor-4,TLR4)等的表達顯著升高,可改善缺血缺氧環境及壞死組織處的血流灌注,糾正骨代謝異常,延緩病情進展[19]。ONFH患者于髓芯減壓術后口服補腎生骨方可以明顯改善髖關節功能,術后1、3、6、12個月進行復查,發現血清中HIF-1α和 VEGF-A 的含量高于術前,認為補腎生骨方能夠通過提高血清中HIF-1α、VEGF-A含量促使血管生成,重建股骨頭血管網絡,使股骨頭得到充分血液供應,延緩病情進展[18]。有學者建立SONFH模型大鼠,分別以0.5 g·kg-1、1.0 g·kg-1、2.0 g·kg-1自擬方生骨再造丸灌胃,發現該方能夠促進股骨頭H型血管標記物股骨頭內皮黏蛋白、CD31、成骨細胞特異性轉錄因子等的生成,且隨著藥物劑量升高,HIF-1α、VEGF、Runx2 mRNA等的表達也隨之升高,認為該藥能通過上調HIF-1α/VEGF通路促進H型血管生成,促進骨修復[20]。

2 中醫藥通過調控miRNA促進血管修復與生成

miRNA是一種可調節基因轉錄的非編碼RNA分子,主要由21～25個長度的核苷酸組成。miRNA作為基因傳遞的天然載體,在臨床治療中表現出積極作用,比如抑制炎癥反應、促進BMSCs增殖分化等[25]。有學者發現,miRNA對調節血管修復與生成既有促進作用,也有抑制作用。miR-27a與BMECs來源的外泌體相互作用后,其本身具備了促OB增殖及血管再生的能力,可以延緩SONFH病情進展,為骨修復提供條件[3]。VEGF作為miR-29b的下游靶點,其RNA 3′翻譯區蛋白與miR-29b作用后,本身的促血管生成能力下降,而當抑制miR-29b表達后,本身的促血管生成能力增強,能夠延緩ONFH病情進展[26]。FoxO1作為miR-135b的靶基因,可以抑制內皮細胞增殖、遷移和血管修復與生成,而表達上調的miR-135b可以逆轉FoxO1抑制性,增高血清中VEGF-A、MMP-2和MMP-9的表達水平,促進HUVECs和BMECs中的細胞遷移和血管生成,治療類固醇引起的SONFH[27]。有學者通過動物實驗得出結論:miR-100-5在ONFH骨組織外泌體中表達上調,并通過調節BMP-R2/SMAD1/5/9通路抑制BMSCs的成骨能力和HUVECs的血管生成能力,促使股骨頭中骨小梁變薄和破壞,而沉默miR-100-5p后能通過激活該通路挽救ONFH骨組織外泌體引起的成骨和血管生成減少[28]。從以上可以了解到miR-27a、miR-135b具有正向調節作用,miR-29b、miR-100-5具有負向調節作用,多是通過調節相關通路、分化因子及蛋白實現的。

使用地塞米松構建SONFH模型小鼠,觀察到miR-206及其靶標HIF-1α在SONFH組織中表達上調,而黃芪多糖能通過下調miR-206表達,激活HIF-1α軸,促進骨細胞自噬、血管修復與生成,并抑制骨細胞凋亡,改善SONFH病情[29]。有學者建立SONFH模型大鼠,使用淫羊藿苷進行治療,發現能夠誘使SONFH模型大鼠血清中的miRNA-335過表達,并促進BMECs的血管成形能力,以提高GCs損傷后的BMECs存活率,改善壞死組織處血供[30]。后期研究發現,淫羊藿苷可調節SONFH患者BMECs中的miRNA-23b表達失衡,保護其血管生成能力,預防疾病發生,認為miRNA-23b是淫羊藿苷預防SONFH疾病發生的作用靶點[31]。

3 中醫藥通過調節TGF-β促進血管修復與生成

TGF-β是一種多功能細胞因子,其功能作用取決于該細胞因子所處的微環境。有學者發現,TGF-β 廣泛存在于機體骨組織、血小板等區域,為骨細胞的重要調節因子。近期發現,TGF-β能促進BMECs增殖分化,在ONFH治療期間起到血管損傷修復和重建的作用[32]。BMP-2隸屬于TGF-β家族,能促進骨細胞外基質合成及BMSCs成骨分化,被應用于骨修復,在ONFH的治療中有重要作用[2]。有研究發現,SONFH確診患者血清中 TGF-β、BMP-2水平顯著低于未確診組,重度SONFH患者血清中TGF-β、BMP-2水平顯著低于中度SONFH患者,認為可以通過觀察TGF-β、BMP-2指標水平,評判SONFH病情,而在進行GCs干預實驗后發現,TGF-β、BMP-2指標水平顯著上升,骨組織再生修復能力上升,末梢血管循環狀態明顯好轉[32]。后期也有學者驗證了這一結果,對SONFH患者進行GCs干預治療,發現患者股骨頭組織內VEGF、TGF-β1、BMP-2 mRNA等水平逐漸上升,股骨頭病理損傷明顯改善,認為SONFH骨修復與血管再生可能和激活TGF-β1/BMP-2通路有關[33]。Runx2作為TGF-β和BMP的共同靶點,是調控BMSCs分化為OB的關鍵轉錄因子,有研究證明Runx2可以促進血管生成[34]。后期有學者發現TGF-β具有抑制Runx2促血管生成的作用,BMP具有促進Runx2促血管生成的作用[35]。也有學者認為,TGF-β通路與Notch、Wnt/β-catenin通路相互抑制或促進,具有調節OC、OB、血管修復等作用[36]。從以上可以了解到,調節TGF-β促進血管修復與生成的作用與BMECs、BMP、Runx2以及多種通路有關,為正向調節作用。

對ONFH患者于髓芯減壓術后以骨移植物治療,發現骨碎補總黃酮可以誘導血管形成,促進VEGF、TGF-β1、BMP-2等再生相關因子表達,升高BMP-SMAD通路蛋白(BMP-2、SMAD1、SMAD4、SMAD5和Runx2)表達,且隨著骨碎補總黃酮劑量的升高,骨移植物生長和礦化的速度加快,認為這一過程與BMP-SMAD通路的激活有關[34]。酒精性ONFH在淫羊藿苷聯合MMP抑制劑GM6001的共同作用下,骨壞死組織處損傷的改善最為明顯,且股骨頭BMP-2、TGF-β、bFGF等細胞因子水平顯著上升,壞死處骨組織內的骨小梁排列、數目、厚度、血清磷、鈣等均有不同程度的改善[37]。

4 中醫藥通過干預炎癥因子促進血管修復與生成

炎癥反應增加是ONFH病情進展的原因之一,ONFH患者血清中BMPs蛋白表達升高后,可減少白細胞介素(interleukin,IL)-34產生,抑制OC分化,促進血管修復與生成,延緩ONFH病情進展[38]?？笽L-6治療可減輕髖關節滑膜炎癥狀和抑制破骨吸收,并促進ONFH修復期的成骨分化[39],因此,抑制炎癥反應可以作為ONFH的一種治療手段。有實驗指出,ONFH患者血清中IL-33明顯高于健康人群,經過治療后IL-33水平逐漸下降,認為 IL-33 可作為預測ONFH的標志物,同時可抑制血管生成、OC生成以及促進骨吸收[40]。后期有學者證實,使用體外沖擊波治療ONFH后,患者血清中 IL-1β、IL-33、IL-17A及其受體IL-17 RA蛋白表達顯著降低,血管生成能力和骨組織再生能力顯著提高[41]。對ONFH患者股骨頭中的微血管形成機制進行研究,發現殘留的骨小梁及硬化結膜組織中存在大量炎性細胞,其中數量最多的是巨噬細胞,其次是T淋巴細胞和B淋巴細胞[42]。近期研究指出,TLR4/NF-κB通路是GCs引起ONFH的重要通路之一,激活TLR4/NF-κB通路會增加腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α釋放,增加炎性反應,影響成骨生成、血管修復與再生[43]。綜上,干預炎癥因子促進血管修復與生成,關鍵在于抑制炎癥因子產生,進行抗炎治療。

通絡生骨膠囊可以通過抑制TLR4通路,減少SONFH大鼠股骨頭組織中骨壞死面積和空骨陷窩率,抑制NF-κB、TNF-α、MyD88、TLR4等蛋白表達,使得骨小梁逐漸粗大、規則,骨細胞形態恢復正常,出現血管重建現象[44]。使用脂多糖、IFN-γ或IL-4處理源自骨髓的巨噬細胞,誘導M1、M2樣表型細胞,發現與未處理的M1巨噬細胞相比,經黃芪甲苷Ⅳ處理過的M1巨噬細胞培養基上誘導的細胞凋亡骨細胞更少,且AS-Ⅳ能降低TNF-α和 IL-1β 的水平。此外,AS-Ⅳ能通過將巨噬細胞從M1型極化為M2型,減輕炎癥反應,促進骨細胞存活及血管再生,緩解ONFH臨床癥狀[45]。雙倍劑量的護骨膠囊比基礎劑量能更好地降低SONFH模型大鼠股骨頭關節囊內關節液TNF-α、IL-6、IL-33 含量,調節血管生成,抑制OC生成及骨吸收,防止SONFH病情的進一步發展[40]。

5 總結

ONFH的發病與治療現已成為國際性問題,血管損壞是導致ONFH病情快速進展的重要原因,局部組織血循不暢,無法支撐骨細胞營養需要,會使骨細胞失去活性[2],因此,促進血管修復與生成對延緩ONFH病情進展有重要作用。中醫藥促進ONFH血管修復與生成涉及PI3K/AKT通路、Notch通路、HIF-1α、miRNA、TGF-β、BMP-2、VEGF、BMECs、炎癥因子等多條途徑,無論是單味中藥有效提取物還是中藥復方,均能通過以上途徑促進血管修復與生成,延緩ONFH病情進展[6,16,19,29,37,44]。就當前研究而言,改善患處血供仍然是臨床治療的一大難題,中醫藥通過調控以上途徑或許可以實現早期干預血管修復與生成,改善局部血供,但是單純使用中醫藥治療ONFH可能面臨著服藥周期長、臨床效果慢、易發生肝腎功能損害等問題,建議采取中醫藥聯合髓芯減壓、打壓植骨等方法共同治療ONFH,以改善病情以及降低不良情況發生率。在未來研究中,可將中醫學與和循證醫學相聯合,在對ONFH辨證論治的同時,結合現代科學理論進行分析,為中醫藥治療ONFH提供客觀、可重復的理論依據。