覆膜鐵罐裝食品中聚對苯二甲酸乙二醇酯及聚對苯二甲酸丁二酯環狀低聚物的測定研究

吳剛,潘家杰,徐彤彤,路秋勉,馮佳寧,孟鎮,仇凱*,郭新光

1(中國食品發酵工業研究院有限公司,北京,100015)2(全國食品直接接觸材料及制品標準化技術委員會金屬制品分技術委員會,北京,100015)3(杭州娃哈哈集團有限公司,浙江 杭州,310009)4(河北工程大學 生命科學與食品工程學院,河北 邯鄲,056009)

覆膜鐵的表面聚酯薄膜材料主要有聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)、聚對苯二甲酸丁二醇酯(polybutylene terephthalate,PBT)、聚丙烯(polypropylene,PP)等,其中以PET最為常見、綜合性能最優、應用最為廣泛[9-14]。這些聚酯材料在由單體發生縮聚反應合成聚合物的生產過程中,由于聚合的不完全或發生熱降解或水解等作用均可能產生低聚物[15-16]。這些低聚物的種類眾多、分子質量大小不一,主要分為線性和環狀結構,且具有不同的毒理學特征[17]。目前國內外均無PET和PBT環狀低聚物毒理學的研究報道,GB 2762—2022 《食品安全國家標準 食品中污染物限量》中也無環狀聚酯低聚物的限量要求,但根據毒理學關注閾值(threshold of toxicological concern,TTC)決策樹方法可將其歸為Cramer Ⅲ類結構[18],大量攝入也可能存在健康風險。

盡管國內外對低聚物的遷移及相關問題進行了大量研究[19-22],但是還未有覆膜鐵實罐中低聚物含量檢測的相關報道。食品中的低聚物的檢測較為復雜,不同的食品基質對低聚物檢測的影響未知,因此迫切需要探索一種簡單易行的樣品前處理方法并確定基質效應的影響,以對覆膜鐵實罐中的低聚物進行檢測分析。本研究采用UPLC-QTOF-MS技術對國內外市場上的31種覆膜鐵罐裝食品中的PET及PBT環狀低聚物進行檢測,并對其建立了樣品前處理方法,以便評估目前市面上覆膜鐵罐裝食品的安全性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑:PET環狀二聚體標準品、PET環狀三聚體標準品、PET環狀四聚體標準品、PET環狀五聚體標準品,北京匯科同創科學儀器有限公司;PBT環狀二聚體標準品、PBT環狀三聚體標準品,北京百靈威科技有限公司;乙腈、甲醇,均為質譜純,上海霍尼韋爾貿易有限公司;六氟異丙醇(色譜純),上海安譜實驗科技股份有限公司;二氯甲烷、正己烷、無水乙醇,均為色譜純,德國Meck公司;甲酸、甲酸銨,質譜純,上海霍尼韋爾貿易有限公司;2,2,2-三氟乙醇(色譜純),西格瑪奧德里奇貿易有限公司;無水MgSO4、NaCl,均為色譜純,中國醫藥上海化學試劑公司;PSA、Al2O3,均為色譜純,上海安譜公司。

儀器:Agilent 1290 UPLC-Agilent 6546 UHD QTOF,美國安捷倫儀器公司;KQ-500DE超聲波清洗儀,江蘇昆山超聲波儀器有限公司;TG18K高速離心機,上海舜制儀器制造有限公司;VORTEX05渦旋混勻器,上海達姆實業有限公司;AB204-N分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;UGC-45C圓形水浴氮吹儀,北京優晟聯合科技有限公司;QSE-12D固相萃取儀,上海比朗儀器制造有限公司。

1.2 實驗樣品

共收集了31種覆膜鐵罐裝食品,包括水果罐頭、肉類罐頭、飲料和啤酒4種食品類型。其中水果罐頭8種,包括黃桃罐頭4種、橘子罐頭3種、山楂罐頭1種,國內相關生產企業;肉類罐頭8種,包括畜禽肉罐頭和水產類罐頭,國內相關企業;飲料樣品共8種,包括國內3種水果汁飲料(桃汁、芒果汁、桔子汁),國內相關生產企業;國外5種水果汁飲料(菠蘿汁、蘋果汁、百香果汁、獼猴桃汁、椰果汁),國內海關;啤酒7種(其中國內啤酒4種,國內啤酒企業提供的精釀啤酒;國外精釀啤酒3種,日本)。

1.3 標準溶液的制備

分別準確稱取各低聚物標準品10 mg至10 mL容量瓶中,用六氟異丙醇(hexafluoroisopropanol,HFIP)溶解并定容至刻度線,得到1 000 mg/L的6種低聚物標準儲備液。分別從6種低聚物標準儲備液中吸取0.1 mL至10 mL容量瓶中,然后用乙腈定容至刻度線,得到10 mg/L的6種低聚物混合標準中間溶液。

標準儲備液配制完成后在20 ℃下儲存,最長可以穩定存放4個月。標準工作液配制完成后在4 ℃下儲存,每隔2周制備1份新的標準工作溶液。由于低聚物性質不太穩定,標準儲備溶液和標準工作溶液均貯存在棕色玻璃瓶中,以防止光誘導降解或異構體轉化。

目前，南海航海保障中心已啟動海區MF-DSC電路改造工作，計劃于2018年底完成并正式啟動廣州通信中心統一值守海區MF-DSC電路工作。

1.4 樣品前處理方法

將樣品內容物全部均質,然后稱取均質樣品2.0 g,置于50 mL離心管中,加入適量混合標準溶液。加入8 mL乙腈(肉類罐頭加入10 mL乙腈和10 mL正己烷),將混合物渦旋振蕩5 min,然后超聲處理20 min,后于4 000×g離心10 min,離心結束后,將離心管取出靜置10 min,吸取上清液(肉類罐頭吸取下層溶液)在常溫下氮吹至干,再用1 mL乙腈復溶,然后過PTFE濾膜,使用UPLC-QTOF-MS檢測分析。

1.5 儀器條件與參數設置

色譜條件:采用了UPLC系統與四極桿飛行時間(time of flight,TOF)質譜儀耦合。分析柱為ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 2.1 mm×50 mm,1.8 μm,溫度控制在40 ℃。流動相(A)為含體積分數0.1%甲酸的水,(B)為含體積分數0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸銨的乙腈,流速為300 μL/min,梯度程序設置如下:0 min(20% B)、3 min(50% B)、15 min(100% B)。設置3 min的平衡時間使流動相達到初始條件。進樣量設置為5 μL。

質譜條件:質譜選用正電離模式,離子源為帶有安捷倫噴射流技術的Jet Stream ESI源。毛細管電壓3 500 V,離子源溫度325 ℃,鞘氣溫度350 ℃,流速11 L/min,霧化器壓力35 psi,干燥氣流速6 L/min,噴嘴電壓500 V,分裂壓力120 V,錐口壓力65 V,Oct 1 RF Vpp為750 V。TOF-MS的采集模式為全掃描MS,在100～1 700 Da的m/z范圍內采集數據。

1.6 數據處理

采用Excel 2019處理試驗數據,采用Origin 2019進行圖表處理與制作。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的選擇與優化

2.1.1 提取溶劑的優化

本實驗分別考察了乙腈、甲醇和二氯甲烷對樣品中PET和PBT環狀低聚物的提取效果,同類樣品平行測定3次,結果如圖1所示,使用甲醇和二氯甲烷作為提取溶劑時,6種低聚物的回收率均較低,尤其是PET環狀二聚體和PBT環狀二聚體的回收率低于80%,當使用乙腈作為提取溶劑時,6種目標物的回收率較好,均在80%～120%,因此,本實驗采用乙腈作為PET和PBT環狀低聚物的提取溶劑。

圖1 乙腈、甲醇和二氯甲烷三種提取溶劑對目標物回收率的影響Fig.1 Effect of three extraction solvents of acetonitrile, methanol and dichloromethane on the recovery rate of the target product

2.1.2 其他條件的優化

在實驗過程中,發現將樣品僅僅經過渦旋處理后,并不能達到很好的提取效果,因此嘗試了在渦旋步驟后對樣品再進行超聲處理,結果發現將樣品超聲處理20 min后可以取得相對更好的提取效果。對于氮吹步驟后所使用的復溶試劑也進行了考察,分別使用了乙腈、甲醇和含體積分數0.1%甲酸銨的乙腈溶液3種試劑進行了實驗比較,結果發現當使用乙腈作為復溶試劑時,所得的溶解效果最好,因此本實驗選擇乙腈作為氮吹處理后的復溶劑。另外,對于肉類食品,由于其內容物基質比較復雜,含有油脂,因此需要選擇合適的有機試劑對肉類樣品進行脫脂處理,經過實驗比對以及對樣品和目標物的綜合考慮,實驗最終決定使用正己烷作為脫脂試劑。

2.2 儀器條件的優化

2.2.1 流動相的選擇與優化

將甲醇和乙腈分別作為流動相和有機相,對相應條件下低聚物的色譜行為進行比較,如圖2所示。結果發現,當以甲醇作為有機相時,部分目標物的響應值較低(圖2-a),而使用乙腈為有機相時,6種目標物的相應值均較好,分離效果也很好(圖2-b)。根據文獻[23],在流動相中添加甲酸-甲酸銨緩沖溶液可以提高PET及PBT環狀低聚物的質譜響應,因此本研究分別考察加入不同濃度甲酸和甲酸銨對目標物峰面積的影響,結果表明,隨著甲酸和甲酸銨濃度的增加,PET及PBT環狀低聚物的峰面積先是顯著增加然后又開始下降,原因可能是隨著加入甲酸濃度的增加,流動相的pH值降低,當流動相的pH值過低時,PET及PBT環狀低聚物在溶液中傾向于以分子型的狀態存在,不利于[M-H]ˉ的形成,因此目標物的峰面積在甲酸濃度過高時表現出下降趨勢。另外,PET及PBT環狀低聚物的峰面積隨著添加甲酸銨濃度的增加表現出先上升后下降的趨勢,可能是因為向流動相中加入銨鹽可以提供NH4+,這有利于PET及PBT環狀低聚物生成[M+NH4]+離子,但是,如果甲酸銨濃度過大時,分子間會產生競爭從而抑制電離,降低目標物的離子化效率。因此,綜合考慮,本實驗最終選擇向流動相中加入體積分數0.10%甲酸和5 mmol/L甲酸銨進行目標物的檢測分析。

a-水-甲醇;b-水-乙腈

2.2.2 其他色譜條件的優化

由于較高的進樣量會顯著影響色譜峰的形狀,因此將進樣量設置為5 μL。實驗發現,目標物在有機相達到50%以上時將開始被洗脫,因此,設置有機相在3 min內上升到50%,然后在10 min內,目標物逐步被洗脫,為了能夠得到更加穩定的效果,將洗脫時間設置為15 min。并且為了達到樣品的高通量檢測要求,設置3 min的平衡時間使流動相達到初始條件。

2.3 基質效應

在樣品中除被分析物以外的組分稱為基質,基質會干擾目標物的分析過程,導致分析結果缺乏準確性,這就稱為基質效應。本研究采用標準曲線法來評估基質效應,通過比較標準溶液標準曲線的斜率和樣品基質標準曲線的斜率來計算基質效應,計算如公式(1)所示。當-50%50%時,表明該化合物的基質效應明顯,不可被忽略。

C/%=(1-Sm/Ss)×100

(1)

式中:Ss,用有機溶劑配成含有系列濃度目標物的標準曲線的斜率;Sm,用食品樣品在提取前加入與Ss相同系列濃度目標物,再經提取步驟后所制得的標準曲線。

從實驗結果(圖3)可以看出,4種罐裝食品中僅肉類罐頭中低聚物的基質效應會在50%以上,說明6種環狀低聚物在水果罐頭、罐裝飲料及罐裝啤酒中的基質效應可以忽略。而在肉類罐頭中,僅PET五聚體的基質效應在50%以下,其余低聚物的基質效應均比較明顯,因此,為了得到更為準確的測試結果,本實驗統一采用基質加標標準曲線對肉類罐頭食品樣品進行定量分析。即采用國內同一廠家生產的非覆膜鐵包裝的、同一批次的同一類型肉類罐頭食品作為空白基質制作標準曲線。

圖3 四種食品類型中被測分析物的基質效應Fig.3 The matrix effect of the tested analytes in the four food types

2.4 線性關系及檢出限、定量限

向食品樣品基質中分別加入20、50、100、200、500、1 000 μg/L 6種不同質量濃度的低聚物標準工作溶液,按照2.1節的前處理方法進行處理后使用UPLC-QTOF-MS分析,每個濃度平行試驗3次。然后以目標物的峰面積(y)為縱坐標,相應的質量濃度(x,μg/L)為橫坐標繪制標準曲線。如果樣品濃度高出線性范圍,則將溶液稀釋適當倍數后再進行測定。結果表明,6種低聚物在20～1 000 μg/L線性關系良好,相關系數均大于0.99。檢出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ)的估計基于信噪比(signal to noise ratio,SNR),LOD=3×SNR,LOQ=10×SNR,得出目標物檢出限為0.11～44.12 μg/L,定量限為0.36～147.06 μg/L,結果詳見表1,表明該方法具有較好的靈敏度。

表1 六種PET及PBT低聚物的線性范圍、標準曲線、相關系數(R2)、檢測限和定量限Table 1 Linear range, standard curve, correlation coefficient (R2), detection limit and quantification limit of six PET and PBT oligomers

2.5 加標回收率和精密度

采用空白樣品加標方法進行加標回收和精密度試驗。分別對水果、飲料、啤酒和肉類進行3個水平(50、100、200 μg/L)加標,每個濃度平行測定6次,計算方法平均回收率和相對標準偏差(relative standard deviation,RSD),所得實驗結果見表2。從結果可以看出,各類食品中低聚物的加標回收率在80.80%～102.71%,RSD在0.37%～9.26%,表明該實驗的回收率和穩定性良好。

表2 水果、肉類、飲料和啤酒四種食品類型中目標物的平均加標回收率和精密度Table 2 The average recovery rate and precision of target substances in the four food types of fruits, meat, beverages, and beer

2.6 真實樣品檢測

從國內外市場上共收集了31種覆膜鐵罐裝食品,包括水果罐頭、肉類罐頭、飲料和啤酒4種食品類型,其中水果罐頭8種、飲料8種、啤酒7種、肉類罐頭8種,采用優化后的前處理方法對這31種食品樣品分別進行檢測,檢測結果見表3。在4種食品類型中,PET環狀三聚體的含量均是最多的,PET環狀三聚體的平均含量從水果罐頭中17.14 μg/L到肉類罐頭中1 155.22 μg/L,遠遠高于其他種類的低聚物。

表3 四種食品類型中6種低聚物的含量 單位:μg/L

本課題組此前已采用不同食品模擬物對覆膜鐵空罐中的PET及PBT環狀低聚物進行了檢測[22],詳見表4。采用食品模擬物對覆膜鐵空罐進行遷移實驗時,PET環狀三聚體的遷移量也是最多的,和本文覆膜鐵罐裝食品中的檢測結果一致。

表4 覆膜鐵樣品中的環狀PET和PBT低聚物的定量結果 單位:μg/L

在實驗所測試的4種食品類型中,低聚物的含量大小順序為:肉類>飲料>水果>啤酒。分析原因可能是肉類罐頭在加工過程中,殺菌溫度約為121 ℃,溫度較高,高溫促使聚合物發生降解,從而使得食品中的PET和PBT環狀低聚物含量增加。水果罐頭和飲料的殺菌溫度相對于肉類罐頭較低,而啤酒一般為巴氏殺菌,殺菌溫度約為65 ℃,因此,啤酒中的低聚物含量最低。另外,啤酒的pH值相較于其他3種食品類型也較高,這使得其對內壁覆膜的腐蝕相對較輕,低聚物的遷出量即隨之減少。

3 結論與討論

本研究通過優化提取溶劑及液相條件,建立了液液萃取-超高效液相色譜-四極桿飛行時間-質譜法對四類覆膜鐵罐裝食品中6種PET及PBT環狀低聚物的測定方法,并對該方法的準確度、精密度及提取效果進行充分驗證及評價,又將該方法成功應用于4種覆膜鐵罐裝食品類型的實際樣品測定過程。該方法成本較低、操作簡單、加標回收率高、重復性良好,能夠為覆膜鐵罐裝食品中PET及PBT低聚物的檢測提供可靠的技術支持。