基于液滴微流控技術選育超高濃釀造啤酒酵母菌株

賀秀麗,侍亞敏,謝鑫,郭立蕓,付曉芬

(北京燕京啤酒股份有限公司技術中心,啤酒釀造技術北京市重點實驗室,北京,101300)

基于降低成本、節能降耗,高濃釀造技術已成為啤酒釀造領域的一個重要研究方向[1],其中,高濃酵母的獲取對釀造的成功與否起到至關重要的作用,由于發酵初期較高的麥汁濃度以及發酵后期的高乙醇濃度,酵母活力降低、發酵緩慢或受阻、發酵周期延長[2],從而要求高濃酵母具備較高的抗逆性能。目前,高濃酵母的研究大多集中在提高對滲透壓的耐受性及酒精的產量方面[3-5],高濃酵母多通過誘變獲得,而傳統的誘變選育存在篩選工作量大、所用試劑多、周期長、篩選出的目標菌株較少、效率低下等缺陷。液滴微流控是新興的菌種篩選方法[6],其利用互不相溶的兩液相產生分散的微液滴,并對微液滴進行操作,是一種非連續流微流控技術[7],可以在短時間內生成大量液滴,這些液滴大小均勻、互不干擾、性能穩定且一致,每個液滴可作為獨立的單位進行微生物的培養[8]。該技術在醫療領域得到廣泛應用[9],在微生物的高通量培養[10]、馴化[11]、篩選[12-13]等方面也展現出重要的應用潛力,也有研究證明其可應用于體外診斷裝置的開發[14]。本研究建立針對高濃菌株的液滴微流控篩選體系,結合常壓室溫等離子體(atmospheric room temperature plasma,ARTP)誘變技術,對出發菌株進行誘變篩選,以期獲得1株性能穩定的高濃釀造菌株,并進行中試規模驗證,為后續菌株在工業生產中的應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養基

釀酒酵母Saccharomycespastorianus02菌株由實驗室菌種保藏中心提供。

液體麥汁培養基:取自產14 °P麥汁,115 ℃滅菌15 min備用。

固體麥汁培養基:液體麥汁中加入20 g/L瓊脂粉,115 ℃滅菌15 min備用。

高濃麥汁培養基:在18 °P麥芽汁中分別加入2、3、4 g/L葡萄糖及麥芽糖的混合物(葡萄糖∶麥芽糖=1∶6,質量比)調節麥芽汁濃度至20～22 °P,115 ℃滅菌15 min備用。

1.1.2 實驗試劑

葡萄糖、麥芽糖,國藥集團化學試劑有限公司;α-葡萄糖苷酶(α-glucosaccharase,α-GC)試劑盒、乙醇脫氫酶Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ,ADH Ⅱ)活性檢測試劑盒,索萊寶科技有限公司。

1.1.3 儀器與設備

MMC-B1全自動高通量微生物液滴培養儀、ARTP-ⅡS常壓室溫等離子體誘變育種儀,無錫源清天木生物科技有限公司;IY1200自動細胞計數儀,上海睿鈺生物科技有限公司;UVmini-1280型紫外-可見光分光光度計,日本島津公司;WFJ 2100型酶標儀,上海尤尼柯儀器有限公司;200 L中試規模糖化及發酵配套生產線,克朗斯股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ARTP誘變

從斜面上挑取出發菌株于10 mL麥汁培養基試管中活化,18 h后取10 μL菌液均勻涂布在載片表面,將涂好的載片以及洗脫液(1.5 mL EP管中加入1 mL無菌水)轉移到ARTP誘變儀中,設置功率120 W,氣量8 L/min,時間梯度0、10、20、30、40、50、60 s[15],等離子照射處理后將載片放至裝有生理鹽水的EP管中,進行振蕩洗脫,并制成新的菌懸液,適當稀釋后取100 μL涂布于平板上,25 ℃條件下培養,計算致死率,選擇致死率85%～95%的處理時間為最適誘變時間。

1.2.2 全自動高通量微生物液滴培養儀馴化

挑取出發菌株于16 °P麥汁培養基中(10 mL/試管),25 ℃靜置培養約18 h,按5%接種量進行轉接,將培養基轉入微生物液滴培養儀中,設定溫度梯度(12、13、14、15 ℃)、麥汁培養基濃度(18、20、21、22 °P)、乙醇體積分數(0%、5%、8%、10%、12%),每個條件下生成10個液滴,分別測定不同條件下菌株的生長曲線,根據生長情況確定菌株的最優馴化條件。

將誘變后的菌液收集在5 mL新鮮的22 °P麥汁培養基中,轉入微生物液滴培養儀中,設定參數如表1,于最佳馴化條件下對誘變菌進行培養,培養約4周后,選取生長情況最好的10個液滴進行斜面保存。

表1 實驗參數的設定Table 1 Setting of experimental parameters

1.2.3 酶活力測定

突變菌細胞內的α-GC和ADHⅡ活力采用相應的試劑盒進行檢測,測定方法詳見試劑盒使用說明。

1.2.4 發酵實驗

用接種環挑取優選菌株于10 mL麥汁試管中,25 ℃培養24 h后轉接至100 mL麥汁中(隨發酵體系的增大,種子液的培養量適當增加),25 ℃培養48 h后,取適量酵母泥接種至22 °P高濃新鮮麥汁中,接種量控制在1.8×107～2.0×107個/mL,14 ℃恒溫發酵至糖度為6 °P時,封罐自然升壓至(0.15±0.20) MPa,發酵8 d檢測雙乙酰,當雙乙酰≤0.08 mg/L開始降溫,24 h降至(0±0.5) ℃,貯酒7 d。

1.2.5 發酵液理化風味指標檢測

酒精度、原麥汁濃度、發酵度、苦味值、雙乙酰、殘糖、總酸和pH等發酵液基本理化指標的檢測均參照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》進行檢測[16],風味物質參照王莉娜等[17]的方法測定。

1.2.6 數據處理

數據處理及作圖使用 IBM SPSS Statistics 26.0和Excel軟件完成。

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變聯合微生物液滴培養高通量篩選體系的建立

2.1.1 ARTP誘變參數確定

將對數生長中期的出發菌株進行ARTP誘變,如圖1所示,隨著離子束照射時間的增長,酵母細胞的存活率迅速下降。當照射時間達到60 s以上時,酵母細胞死亡率為100%;處理時間為35 s左右,致死率為87.9%。因此我們選定出發菌株進行ARTP誘變的照射處理時間為35 s。

2.1.2 微生物液滴培養馴化參數確定

對不同溫度、麥汁濃度、乙醇體積分數條件下菌株02的生長曲線進行測定,如圖2所示,隨著溫度的升高,菌株增殖速率加快;不同麥汁濃度下菌株生長情況差異不大,其中低濃度麥汁中菌株生長OD值偏高一些,但優勢并不明顯;菌株02在高濃環境下生長主要受到乙醇的抑制,乙醇體積分數達到10%,對菌株生長有明顯的抑制,5%和8%時有輕微抑制;綜合考慮,微生物液滴培養馴化參數為:培養溫度為15 ℃;培養基為22 °P麥汁;馴化壓力乙醇體積分數為5%～10%。

a-溫度;b-麥汁濃度;c-乙醇濃度

2.2 高濃菌株的誘變選育

2.2.1 誘變及微生物液滴培養初篩

將出發菌株在ARTP誘變儀上處理35 s后,制成懸浮液轉入微生物液滴培養儀中,選擇“適應性進化”功能模塊,按照設定參數運行。如圖3,出發菌株經ARTP誘變后轉入微生物液滴培養儀中,在不添加乙醇的麥汁中培養2代后轉入5%乙醇體積分數的麥汁培養基;培養7代后提取生長狀態較優的液滴然后轉入7%乙醇體積分數的麥汁培養基,重復操作直到9%乙醇體積分數。

圖3 微生物液滴培養馴化實驗結果圖Fig.3 Results of MMC domestication experiment

如圖4所示,伴隨乙醇體積分數的升高,菌株生長均受到抑制,生物量逐漸降低,各誘變菌在同一乙醇體積分數下的生長狀態不盡相同,根據不同乙醇體積分數下分選液滴的狀態,篩選出40株生物量較高的誘變菌株(如圖4紅點所示)。

2.2.2 糖代謝能力復篩

α-GC與ADHⅡ是酵母糖代謝與乙醇代謝過程中重要的酶,α-GC能夠將麥芽糖、蔗糖、麥芽三糖等低寡聚糖分解為單糖,促進酵母對糖的吸收;乙醇在ADHⅡ作用下轉化為乙醛,進而在乙醛脫氫酶的作用下生成乙酸,有助于緩解乙醇對酵母的毒害。檢測α-GC和ADHⅡ的活性對監測酵母糖代謝過程是否正常以及篩選高乙醇耐受菌株具有重要意義[18-19]。對2.2.1節中獲得的初篩菌α-GC及ADHⅡ活力進行檢測,結果如圖5所示。各誘變菌株的α-GC活力與乙醇梯度關聯不明顯,隨著乙醇梯度的升高,酶活力并沒有呈現明顯的正相關或負相關,而ADHⅡ活力與乙醇梯度呈正相關,即隨著乙醇體積分數的升高,酶活力數值也逐漸變大。綜合酶活力和各菌株生長結果,篩選出7株糖代謝力強、耐高乙醇體積分數、生長優勢明顯的菌株。

圖5 各誘變菌株的α-GC(a)和ADHⅡ(b)活力結果Fig.5 Enzyme activity of α-GC(a) and ADHⅡ(b) of each mutant strain

2.2.3 實驗室發酵

對2.2.2節中獲得的7株誘變優良菌株進行2 L量筒發酵實驗,檢測發酵過程及發酵結束后的關鍵指標,結果見表2及表3。菌株8-2和9-50的增殖倍數更高,降糖速率更快,回收酵母泥的死亡率較低,這說明其在22 °P麥汁條件發酵時的細胞活性較好,耐受高濃能力更強。發酵結束后,菌株9-50的發酵度達到68.4%,發酵更完全,醇酯香氣濃郁,口感更協調,所以選擇菌株9-50進行中試規模測試。

表2 誘變菌株的發酵過程指標Table 2 Indicators of fermentation process of mutant strains

表3 發酵結束后的理化指標與風味指標Table 3 Physicochemical and flavor indexes of mutant strain at the end of fermentation

2.3 中試規模發酵

如圖6所示,中試發酵過程中,菌株9-50的酵母增殖旺盛,無明顯遲滯期,細胞死亡率低于5%,達到特定酒精度的發酵周期縮短42 h,而且后期酵母沉降較快,有利于酵母泥的回收傳代,可見優選菌株能夠快速適應高濃環境,迅速起酵,并且在高滲透壓環境下表現出較好的細胞活性。吳卓凡[20]的研究也發現高濃釀造菌株M14在發酵后期糖利用較強,細胞性能下降較少,平板死亡率更低的現象,且與出發菌株相比,M14中與碳代謝及氨基酸代謝的基因發生了顯著變化。郭璇[21]發現,高濃環境下酵母為抵抗高滲透壓高乙醇,可能會抑制某些胞內蛋白的合成,從而造成發酵性能的改變。

從理論上講,發酵性能良好的酵母泥,可使用多代。在實際生產過程中,由于酵母菌種本身的變化及外界微生物的污染,隨著酵母使用代數的增加,其發酵性能和活力等會降低,死亡率、衰老比例等會有所上升,一般啤酒廠的優良菌種回收的酵母泥需控制在能連續使用5～7代[22]。表4展示了9-50與對照酵母泥的主要性能,2組的電導率、活力和自溶系數無顯著性差異,菌株9-50的死亡率比對照菌低64%,與發酵過程中死亡率情況相對應,在凝聚性方面,9-50的凝聚性比對照菌高48.1%,符合發酵后期酵母沉降較快情況。

表4 回收酵母泥的相關指標Table 4 Indicators of yeast mud

發酵結束后貯酒7 d的成品酒理化風味指標檢測結果(表5)顯示,與對照菌相比,菌株9-50在原麥汁濃度略低于出發菌株的情況下,發酵度比對照組提高了約2%,這表明優選菌株9-50能更好的適應高濃環境,發酵更完全。乙醛是影響啤酒風味組成和風味穩定性最重要的醛類化合物,乙醛含量過高時會帶來不愉快的青蘋果味、青草味和氧化味等,進一步引起“上頭”等不適生理反應[23],一般優質成熟的工業啤酒中乙醛質量含量在2～10 mg/L[24],菌株9-50發酵后的成品酒乙醛含量低于對照28.8%,這表明該菌株具有較好的乙醛還原能力。本次實驗2組的總酯含量均偏高,主要是因為酯的形成與麥汁濃度息息相關,12 °P以下的麥汁一般不存在酯多的問題,但是超過一定限度(如>15 °P)時,即便接種量也按比例增加,由于代謝產物的增加,使脂肪酸的合成減少,酯的形成增加[25]。同時,發酵在14 ℃的高溫下進行,有利于酯的生成,但優選菌株的總酯含量顯著低于出發菌株11%。

表5 成品酒理化指標與風味物質含量Table 5 Physicochemical indexes and flavor content of finished beer

2.4 遺傳及發酵穩定性實驗

誘變選育獲得的菌株易發生優勢性狀的回復突變,其穩定性需要進行長時間的針對性馴化和適宜的保藏方法來維持。對優選菌株9-50持續進行4個月的高濃麥汁馴化實驗,連續傳代20次后,分別取第0、1、2、5、10、15、20代進行發酵驗證。由圖7可知,經過多次傳代后,菌株的增殖倍數穩定在4左右,降糖時間穩定在160 h,且隨著馴化傳代次數的增加,細胞死亡率在10代之后顯著降低,維持在2%～3%之間,具有良好的遺傳穩定性。發酵結束后的關鍵理化風味指標結果顯示(表6),各代菌株發酵后的酒精度、發酵度無明顯差別,酒精度可達到10%vol,發酵度基本在65%左右,高級醇(總醇)波動在160～180 mg/L,揮發酯(總酯)含量在10代以后呈現小幅增加,但整體維持在60～80 mg/L,具有較好的發酵穩定性。

圖7 不同代數的發酵過程指標Fig.7 Fermentation process index of different algebras

表6 發酵結束后理化指標與風味物質含量Table 6 Physicochemical index and flavor content after fermentation

3 結論

本研究基于微液滴培養技術選育超高濃釀造菌株,建立了ARTP誘變聯合液滴微流控技術選育高濃釀造菌株的方法,確定了微流控選育的最佳馴化條件:培養溫度為15 ℃,麥汁濃度22 °P,馴化的乙醇體積分數為5%～10%,應用該方法選育得到高濃釀造菌株9-50,該菌株乙醇脫氫酶活性高,可以耐受9%的乙醇體積分數。在22 °P,14 ℃條件下發酵,與出發菌株相比,增殖旺盛,降糖時間縮短42 h,發酵度>66%,雙乙酰含量0.06 mg/L,乙醛含量降低28.8%,揮發酯含量降低11%,醇酯香氣較協調,具有良好的工業應用前景。