CaCl2處理增強Debaryomyces nepalensis對冬棗采后黑斑病的控制效果及機制

蔡蜨,雷興夢,王文軍,2,曾凱芳,2,3*

1(西南大學 食品科學學院,重慶,400715)2(川渝共建特色食品重慶市重點實驗室,重慶,400715)3(國家柑桔工程技術研究中心,重慶,400712)

棗果實富含維生素C、礦物質、氨基酸和碳水化合物等營養成分,被廣泛作為傳統功能性食品食用[1]。然而,棗果實貯藏期間易遭受病原菌入侵,導致病害發生[2]。由鏈格孢菌(Alternariaalternata)引起的黑斑病是冬棗采后常發生的病害之一。A.alternata可以產生細交鏈孢菌酮酸等霉菌毒素對人類健康造成嚴重威脅[3]。目前,代森猛鋅、異菌脲和戊唑醇等化學殺菌劑已被廣泛應用于A.alternata的控制[4-5]。然而,化學殺菌劑的耐藥性以及對消費者健康帶來的潛在危害,使得其不能廣泛應用于實際生產[3]。因而,尋找能夠有效防治冬棗黑斑病的綠色、安全環保的方法顯得尤為重要。

拮抗酵母因對環境耐受性高,且為有益抗菌物質而被廣泛應用于果蔬采后生物防治[6]。已有研究報道,尼泊爾德巴利酵母(Debaryomycesnepalensis)可以通過產生揮發性抗菌物質、誘導果實抗病性以及形成生物膜來有效地控制芒果采后炭疽病的發生[7]。經本實驗室前期研究發現,D.nepalensis能夠在冬棗果實表面形成生物膜,通過和病原菌競爭營養空間,從而控制冬棗采后黑斑病[8]。但單一的拮抗酵母對果蔬采后病害的防治效果遠不如化學殺菌劑,這也導致了拮抗酵母商品化程度較低[9]。

低劑量的化學物質(植物激素類、金屬鹽類)復合拮抗酵母處理,是一種有望將拮抗酵母生防效力顯著提升的方法[10]。已有研究表明,用0.2 mmol/L水楊酸復合膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)使用,能顯著控制柑橘青霉病的發生[11]。同樣,用20 g/L NaHCO3復合海洋生防酵母(Rhodosporidiumpaludigenum)處理,也能夠顯著降低柑橘綠霉病的發生[12]。CaCl2已被證實為一種安全有效的化學殺菌劑,能夠通過增強橄欖假絲酵母(Candidaoleophila)對蘋果果實的誘導抗性控制蘋果采后青霉病的發生[13-14]。除此之外,外援Ca2+處理,還能夠通過增強酵母抗氧化活性,減少活性氧的積累提高其抗病能力[15]。目前,CaCl2是否能夠增強D.nepalensis對冬棗采后黑斑病的控制效果還有待研究。

本文用不同濃度CaCl2與D.nepalensis復合處理,篩選出控病最佳復合比例,并探究其作用機制,以期為冬棗采后黑斑病防控提供理論依據和應用參考。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

材料:實驗所用冬棗購自北碚區開心水果店。選取成熟度一致,大小均勻且無機械傷的冬棗果實作為實驗備用材料。經預冷后,放入凍庫暫存。

菌種:Debaryomycesnepalensis和Alternariaalternata為本實驗室自行分離、鑒定和保存的菌種。經活化后備用。

主要試劑:亮抑酶肽、乙酰溴、冰醋酸、甲醇、4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)提取試劑、正己烷、硼酸、D-葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽、叔丁醇,重慶躍翔化工有限公司;輔酶A,北碚區瑪頓實驗設備經營部;p-香豆酸,重慶擇物生物科技有限公司;酵母浸粉(分析純),重慶興光化玻公司;瓊脂粉(分析純)、ATP,重慶阿米達生物科技有限公司;福林酚,重慶千重山生物科技有限公司;H2O2,重慶興光化玻公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2F潔凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;BXM30R立式壓力蒸汽滅菌器,上海博迅實業有限公司醫療設備廠;ZWF-211搖床,重慶邁新科技發展有限公司;B203生物顯微鏡,重慶奧特光學儀器有限公司;DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱,上海齊欣科學儀器有限公司;S-3400 NII掃描電鏡,日本HITACHI公司;SYNERGYH1MG全自動酶標儀,美國BioTek公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 離體條件下CaCl2對D.nepalensis和A.alternata生長狀況的影響

1.3.1.1 CaCl2在YEPD培養基中對D.nepalensis生長狀況的影響

將10 mL不同質量濃度的CaCl2溶液加入到含有90 mL YEPD液體培養基的錐形瓶中,使CaCl2的終質量濃度達到0、5、10、20、40 g/L。之后,接入1 mL 1×108CFU/mL的D.nepalensis細胞懸浮液,并于28 ℃、200 r/min的搖床中培養24 h后計數。每個處理組重復3次。

1.3.1.2 CaCl2在PDA培養基中對A.alternate生長狀況的影響

在含有質量濃度為0、5、10、20、40 g/L CaCl2的PDA培養基中央接入10 μL 1×106CFU/mLA.alternate孢子懸浮液,用封口膜封住平板并放置在25 ℃恒溫培養箱中培養7 d后記錄病斑直徑并拍照。每個處理組重復3次。

1.3.2 CaCl2與D.nepalensis復合處理對冬棗果實采后黑斑病的抑制效果

將冬棗果實浸入2%(體積分數)NaClO溶液中浸泡,2 min后用清水沖凈,將其隨機分為5組,放置于工作臺上自然晾干。用無菌槍頭在冬棗果實的赤道部位等距打孔(直徑3 mm,深度3 mm),每個處理組果實的傷口處分別加入20 μL下列液體:(1)1×108CFU/mLD.nepalensis懸浮液;(2)5 g/L CaCl2與1×108CFU/mLD.nepalensis混合懸浮液;(3)10 g/L CaCl2與1×108CFU/mLD.nepalensis混合懸浮液;(4)20 g/L CaCl2與1×108CFU/mLD.nepalensis混合懸浮液;(5)40 g/L CaCl2與1×108CFU/mLD.nepalensis混合懸浮液;4 h后,再在棗果實傷口處接入10 μL 1×106CFU/mLA.alternate孢子懸浮液,待菌液完全吸收后,單果包裝置于25 ℃、相對濕度為90%～95%條件下貯藏。每2 d測定冬棗果實的發病率和病斑直徑。每個處理組10個果實,重復3次。

1.3.3 CaCl2處理后對D.nepalensis在冬棗果實傷口處定殖能力的影響

1.3.3.1 CaCl2處理后對D.nepalensis在冬棗果實傷口處生長動態的影響

冬棗處理:果實處理同1.3.2節,每個孔分別加入20 μL 1×108CFU/mLD.nepalensis懸浮液、5 g/L CaCl2與1×108CFU/mLD.nepalensis混合懸浮液,置于25 ℃、相對濕度為90%～95%條件下貯藏。以第0天(接種后2 h)測定的酵母數為起始值,每天取樣,連續測定7 d。取樣時,用無菌打孔器挖取傷口處直徑為1 cm的果肉組織,放入裝有10 mL PBS(50 mmol/L,pH 6.8)的消毒研缽中研磨成勻漿,之后進行梯度稀釋,并吸取100 μL稀釋液涂布在YEPD平板上,將其置于28 ℃下培養,48 h后計數。每個處理重復3次,每個重復3個果實。結果用每個傷口的酵母活菌數量表示,單位為lg CFU/wound。

1.3.3.2 掃描電鏡觀察D.nepalensis與A.alternate在果實傷口處的生長動態

將冬棗果實隨機分為8組,果實處理同1.3.2節。每個孔分別接入(1)20 μL無菌水;(2)20 μL 5 g/L CaCl2;(3)20 μL無菌水,4 h后再在每個孔接種10 μL 1×106CFU/mLA.alternate懸浮液;(4)20 μL 5 g/L CaCl2,4 h后再在每個孔接種10 μL 1×106CFU/mLA.alternate懸浮液;(5)20 μL 1×108CFU/mLD.nepalensis懸浮液;(6)5 g/L CaCl2與1×108CFU/mLD.nepalensis混合懸浮液;(7)20 μL 1×108CFU/mLD.nepalensis懸浮液,4 h后再在每個孔接種10 μL 1×106CFU/mLA.alternate懸浮液;(8)5 g/L CaCl2與1×108CFU/mLD.nepalensis混合懸浮液,4 h后再在每個孔接種10 μL 1×106CFU/mLA.alternate懸浮液。貯藏方法同1.3.2節。2 d后,采用掃描電鏡觀察。電鏡樣品制作參照LEI等[8]的方法。

1.3.3.3 CaCl2處理后對D.nepalensis生物膜生成能力的影響

實驗參照LEI等[8]的方法,并稍作修改。D.nepalensis在YNB(含葡萄糖100 mmol/L)培養基中28 ℃過夜培養后,收集菌體,用PBS(50 mmol/L,pH 7.2)洗滌2次,然后分別用YNB培養基和含有5 g/L CaCl2的YNB培養基調整酵母細胞濃度為1×107CFU/mL。分別吸取100 μL加入到96孔聚苯乙烯板的8個孔內。無酵母懸浮液的YNB培養基為對照。在28 ℃恒溫搖床中以75 r/min的轉速培養。在培養的3、24、48、72 h后,用150 μL PBS洗滌2次,隨后加入100 μL 40 g/L的結晶紫溶液染色45 min,染色結束后用無菌水洗滌4次,并立即加入200 μL 95%(體積分數)的乙醇進行脫色。脫色45 min后,移取100 μL脫色液到另一塊96孔聚苯乙烯板孔內,在590 nm處測定吸光值。吸光值的大小用來表示生物膜生成量的多少。以不接種酵母的YNB(含葡萄糖100 mmol/L)培養基校正空白,每個處理3個重復,每個重復8個復孔。

1.3.4 CaCl2與D.nepalensis復合處理誘導冬棗果實抗病性機制

1.3.4.1 樣品處理及取樣

冬棗處理:果實處理同1.3.3.1節。在貯藏的第0、1、2、3、4、5天對冬棗果實取樣,取樣時,用無菌打孔器在果實傷口周圍取直徑為3 mm的果實組織。每個處理3次重復,每個重復15個果實。

1.3.4.2 酶活力測定

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、肉桂酸-4-羥基化酶( cinnamate-4-hydroxylase,C4H) 、4-香豆酸輔酶 A 連接酶( 4-coumaric acid coenzyme-A-ligase,4CL)活性測定參照張靜茹[16]的方法。

過氧化物酶(peroxidase,POD)活力的測定參考曹建康等[17]的方法,以每克鮮重(fresh weight,FW)棗果實樣品每分鐘吸光度變化值增加1時為1個過氧化物酶活性單位(U)。

1.3.4.3 總酚、類黃酮、木質素含量的測定

總酚、類黃酮的提取方法參照DENG等[18]的實驗方法;總酚、類黃酮和木質素的測定方法參照張靜茹[16]的方法。

2 結果與分析

2.1 離體條件下CaCl2對D.nepalensis和A.alternata生長狀況的影響

2.1.1 CaCl2在YEPD培養基中對D.nepalensis生長狀況的影響

如圖1所示,將D.nepalensis與不同濃度的CaCl2混合培養24 h后,當CaCl2的質量濃度為5、10、20 g/L時,能顯著促進D.nepalensis的生長(P<0.05),然而,當CaCl2的質量濃度達到40 g/L時,D.nepalensis的數量與未加CaCl2時無顯著差別(P>0.05)。這與蔡孟軒等[14]的研究結果類似,高濃度Ca2+會抑制酵母生長,低濃度Ca2+卻促進酵母生長。這可能與高濃度Ca2+增加酵母胞外滲透壓,造成細胞胞內物外泄,細胞破裂而死亡有關。而低濃度Ca2+可以提供酵母所需要的營養物質,促進酵母生長。

2.1.2 CaCl2在PDA培養基中對A.alternate生長狀況的影響

如圖2所示,A.alternate在添加了5、10、40 g/L CaCl2的PDA培養基中培養7 d后,病斑直徑顯著高于未加CaCl2的對照組(P<0.05);而在添加了20 g/L CaCl2的PDA培養基中培養7 d后,病斑直徑與對照組無顯著區別(P>0.05)。這說明所選濃度的CaCl2對A.alternate均無直接抑菌作用,且一定濃度范圍的CaCl2還可以提供A.alternate生長所需的營養元素促進其生長。

a-病斑直徑;b-A.alternate生長圖片

2.2 CaCl2與D.nepalensis復合處理對冬棗果實采后黑斑病的抑制效果

如圖3所示,在貯藏期間,5 g/L CaCl2與D.nepalensis復合處理后,能降低棗果實黑斑病的發病率和病斑直徑,且控制效果顯著強于D.nepalensis單獨處理(P<0.05)。10 g/L CaCl2與D.nepalensis復合處理后,發病率僅在第2天時,顯著低于D.nepalensis單獨處理(P<0.05)。20 g/L CaCl2與D.nepalensis復合處理后,在貯藏的第2、4、6天時,棗果實發病率與D.nepalensis單獨處理組無顯著差別(P>0.05),而在第8、10天時反而促進棗果實的發病。40 g/L CaCl2與D.nepalensis復合處理后,在貯藏期間,發病率和病斑直徑都顯著高于D.nepalensis單獨處理組(P<0.05)。同樣的結果在SUN等[19]的研究中也有發現。高濃度的化學添加劑復合拮抗酵母處理后,促進病害發生,這可能是因為化學添加劑本身對果實傷害較大,降低了果實的抵抗力,利于病原菌入侵。綜上,后續實驗選用對棗果實黑斑病控制效果最好的復合比例(5 g/L CaCl2與D.nepalensis復合)進行研究。

2.3 CaCl2處理后對D.nepalensis在冬棗果實傷口處定殖能力的影響

2.3.1 CaCl2處理后對D.nepalensis在冬棗果實傷口處生長動態的影響

如圖4所示,D.nepalensis能夠在棗果實傷口處迅速定殖、擴增。且經過5 g/L CaCl2與D.nepalensis復合處理后,能夠明顯促進D.nepalensis的生長(P<0.05)。在貯藏第1天時,5 g/L CaCl2與D.nepalensis復合處理后,D.nepalensis的數量比剛開始接種時增加16.17%,且比D.nepalensis單獨處理組的數量增加4.13%。AHIMA等[11]用水楊酸復合R.mucilaginosa處理后,發現R.mucilaginosa在柑橘果實傷口處的數量增加。

圖4 CaCl2對D.nepalensis在冬棗果實傷口處生長動態的影響Fig.4 Effects of CaCl2on the growth dynamics ofD.nepalensis in the wound of jujube

2.3.2 SEM觀察D.nepalensis與A.alternate在果實傷口處的生長動態

如圖5-a1、圖5-a2、圖5-b1、圖5-b2所示,經過5 g/L CaCl2處理后,對棗果實傷口處組織以及A.alternate的菌絲無顯著影響。如圖5-c1、圖5-c2所示,D.nepalensis經多次沖洗,依然能夠穩定地附著在棗果實傷口處,形成密集壁壘,且經5 g/L CaCl2處理后,在D.nepalensis表面有一層膜狀物生成,更加緊密地將D.nepalensis結合。LEI等[8]研究發現,苯乙醇作為D.nepalensis的群體感應分子能夠促進D.nepalensis生物膜的形成,進而提高D.nepalensis生防效力。本研究發現CaCl2處理后可以增強D.nepalensis生物膜生成能力,這是否與CaCl2能夠增加酵母苯乙醇生成量有關,還有待后續研究。如圖5-d1、圖5-d2所示,D.nepalensis能夠緊緊附著在A.alternate菌絲周圍,使其不能夠有效接觸到冬棗果實表面,且經5 g/L CaCl2和D.nepalensis復合處理后,A.alternate菌絲發生了變形和皺縮的現象。

a-冬棗果皮傷口處組織;b-A. alternate在冬棗果實的生長動態;c-D. nepalensis在冬棗果皮傷口處的生長動態;d-A. alternate和D. nepalensis在冬棗果實的生長動態圖5 掃描電鏡下D.nepalensis與A.alternate在果實傷口處的生長狀態Fig.5 Growth status of D.nepalensis and A.alternatein fruit wounds under scanning electron microscope注:a1～d1:無CaCl2;a2～d2:加CaCl2;圖為放大5 000倍的圖。

2.3.3 CaCl2處理后對D.nepalensis生物膜生成能力的影響

如圖6所示,在培養的3、24、48、72 h,經PBS和無菌水多次沖洗后,D.nepalensis依然能夠穩定附著于96孔板上。且在3、48、72 h時,經5 g/L CaCl2處理后的OD590值顯著大于D.nepalensis單獨培養組。這進一步說明5 g/L CaCl2處理后,能夠增強D.nepalensis的生物膜形成能力。

2.4 CaCl2與D.nepalensis復合處理誘導冬棗果實抗病性機制

2.4.1 對冬棗果實PAL、C4H、4CL、POD活力的影響

苯丙烷代謝途徑與酚類等化合物的生成有關,可以誘導其產生化學或者物理屏障來加強植物細胞壁的結構,從而阻止病原菌的浸染[3]。PAL是苯丙烷代謝途徑當中的關鍵限速酶[20],與酚類、木質素等植物防御及抗病相關物質的合成關聯。當PAL活力增強時,果實能夠提高自身防御能力抵御外來侵害。如圖7-a所示,經5 g/L CaCl2處理后,在貯藏的第1天～第4天,冬棗果實PAL的活性顯著高于D.nepalensis單獨處理組(P<0.05),且在第3天時達到最高,在貯藏的第4天,5 g/L CaCl2復合D.nepalensis處理組PAL活性是D.nepalensis單獨處理組的1.44倍。在貯藏期間PAL活力呈現先上升后下降再上升后下降的趨勢,這樣的現象與張靜茹[16]結果表現出一致性,這可能是因為在PAL使L-苯丙氨酸生成肉桂酸的過程中,給PAL自身的活性造成了負反饋調節[21]。

C4H與果實中p-香豆酸的合成密切相關,調節著咖啡酸及阿魏酸等酚酸物質的合成,這些物質的生成,可以對病原微生物起到直接殺菌作用[20]。如圖7-b所示,在貯藏的第1天、第5天,5 g/L CaCl2復合D.nepalensis處理組C4H活力顯著高于D.nepalensis單獨處理組(P<0.05),且在第1天時,達到最高,相比D.nepalensis單獨處理組的C4H活性高了51.53%。這樣的結果與ZHANG等[22]用紫外處理防治油桃采后褐腐病結果類似,通過外界刺激,激活了苯丙烷代謝途徑中C4H活性,從而達到抑菌目的。

4CL在苯丙烷代謝途徑當中是生成不同產物的轉折點,參與調節植物與病原微生物的相互作用,與輔酶A酯的合成有關[23]。如圖7-c所示,在貯藏的1、3、4、5 d,5 g/L CaCl2復合D.nepalensis處理組的4CL活性顯著高于D.nepalensis單獨處理組(P<0.05),且都呈現先上升后下降的趨勢。貯藏的第4天時,處理組4CL活性為對照組的1.26倍。類似的結果在ZHANG等[22]的研究中也有發現。

當植物處于逆境時,會刺激活性氧(reactive oxygen species,ROS)爆發,從而使病原菌更易侵染,而POD作為消除活性氧的主要保護酶,與維持活性氧平衡及植物抗性密切相關[24]。除此之外,POD增加后還能自發耦合成單酚自由基并合成木質素聚合體,加固細胞壁。如圖7-d所示,在貯藏的第2、3、4天,5 g/L CaCl2復合D.nepalensis處理組的POD活性顯著高于D.nepalensis單獨處理組(P<0.05),且都呈現逐漸增加的趨勢。類似的結果在蔣超男等[25]的研究中也有報道。

2.4.2 對冬棗果實總酚、類黃酮、木質素含量的影響

作為苯丙烷代謝途徑終產物的總酚、類黃酮、木質素,與植物抗性息息相關。酚類具有強抗氧化性和抗病性且為木質素合成的前體物。類黃酮能夠控制病原微生物在未被侵染的細胞中繁殖擴增,類黃酮含量的多少、產生的速度,通常與植物抗病性呈正相關。而木質素作為細胞壁的主要成分,是植物抵御病原菌入侵的重要保護壁壘。如圖8-a所示,經5 g/L CaCl2與D.nepalensis復合處理后,在貯藏的第4天,總酚的含量顯著高于D.nepalensis單獨處理組(P<0.05),且為D.nepalensis單獨處理組的1.05倍。如圖8-b所示,在貯藏的第1、2、4天,5 g/L CaCl2與D.nepalensis復合處理組冬棗果實類黃酮含量顯著高于D.nepalensis單獨處理組(P<0.05)。如圖8-c所示,在貯藏的第1、3、4天,5 g/L CaCl2與D.nepalensis復合處理組冬棗果實木質素含量顯著高于D.nepalensis單獨處理組(P<0.05),在第4天時達到最高,且木質素含量是D.nepalensis單獨處理組的1.27倍。在處理的整個貯藏期內,總酚、類黃酮及木質素含量的變化趨勢表現出一致性,都為先增加,后下降,再增加后下降的趨勢。這可能是由于終產物的積累,導致上游反應途徑出現負反饋調節造成的。同樣的結果在蔡孟軒等[14]和蔣超男等[25]的研究中也有發現。

a-總酚含量;b-類黃酮含量;c-木質素含量

3 結論

本文用5 g/L CaCl2與D.nepalensis復合處理后發現,CaCl2能夠通過增強D.nepalensis的生物膜生成能力以及增強D.nepalensis誘導果實抗性,激活苯丙烷代謝途徑,提高POD、PAL、C4H、4CL活力以及提升總酚、類黃酮和木質素等物質含量從而提升D.nepalensis對冬棗果實采后黑斑病的控制效果。因此, CaCl2與D.nepalensis的復合使用,可以提升D.nepalensis的生防效力,為D.nepalensis的商業化應用提供新的增效方法和思路。