比較初乳乳房拭子與仔豬睪丸處理液對6種豬繁殖障礙相關病毒的監測效果

祁松，張哲瑋，朱晶，羅宇山，董德文，貝為成，3，4*

(1. 華中農業大學動物醫學院，農業微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430070；2. 廣西翔儀生物工程有限公司，廣西 南寧 530000；3. 湖北洪山實驗室，湖北 武漢 430070；4. 生豬健康養殖協同創新中心，湖北 武漢 430070)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環病毒2型(PCV-2)、豬細小病毒(PPV)和豬圓環病毒3型(PCV-3)是豬場常見與豬繁殖障礙有關的6種病毒，常導致感染母豬流產，高返情率，產死胎、木乃伊胎、弱仔和引起哺乳仔豬及保育豬發病和死亡，給豬場帶來巨大的經濟損失[1]。因此，有效監測豬群中相關病原的感染狀況對疫病的防控意義重大。當前，豬場一線獸醫對疫病監測所采集的樣品主要以血清、扁桃體拭子、口腔液、環境樣品和仔豬睪丸處理液為主。扁桃體是非洲豬瘟(ASFV)、PRRSV、CSFV、PRV及胸膜肺炎放線桿菌等病原復制和定居的重要場所，利用扁桃體拭子可準確地診斷豬群感染疫病病原[2]。而所謂口腔液，是指口腔中的唾液和血清滲出液的混合液體，其中血清滲出液是通過口腔黏膜以及口腔黏膜上的齒齦溝和毛細血管進入口腔，其既可用于抗體檢測也可用于PCR檢測抗原，是多種傳染病高效監測技術手段的樣品來源[3]。近年來，仔豬睪丸處理液成為規模豬場監控PRRSV高效且更為便利的樣品來源，其敏感度要高于血清[4]，但關于睪丸處理液對豬其他繁殖障礙相關病毒，如PCV-3、PPV等的檢測報道較少。Dvorak等[5]報道了PCV-2在母豬口腔液、初乳和仔豬血清三者之間的病毒載量差異，初乳的檢測敏感度要高于仔豬血清，提示初乳也可作為高效的樣品來源，且能反映病原經乳汁垂直傳播的情況。Voicu 等[6]也報道了PRRSV能通過母豬初乳和常乳進行傳播，進而作為地方流行的一種傳播途徑。其次，初乳拭子樣品不僅能為豬場獸醫提供預警信息，而且能為其針對疫病防控來優化生產管理方案提供一定的參考信息，如當在初乳拭子中檢測到某種病原時，豬場管理者可以通過減少弱仔寄養、加強生物安全和免疫保健等措施來降低病原的水平傳播程度以及后續危害等。

為了評估母豬初乳乳房拭子對豬多種繁殖障礙性病毒的檢測敏感性，同時比較其和睪丸處理液對不同的病毒檢出率差異，本文以河南某規模豬場豬為研究對象，使用實時熒光定量PCR(qPCR)的方法，對隨機不分胎次采集的113份(452頭母豬的4混1樣)母豬初乳乳房拭子和171份(684窩仔豬的4混1樣)仔豬睪丸處理液進行PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PCV2和PCV3的病原學檢測，另外再單獨采集38頭1胎母豬的初乳乳房拭子及其所產3～5日齡仔豬的睪丸處理液進行病原學檢測，旨在為規模豬場對疫病監測采集合適的樣品提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

河南某5 000頭規模母豬場，年窩均出生總仔為15.3頭，其中1胎母豬的年平均死胎率為10.6%，2胎及以上母豬的年平均死胎率為3.2%～5.3%，1胎母豬的年平均死胎率要顯著高于其他胎次。其他生產情況均較為正常，近2年來未出現重大生產問題。樣品采集于2022年8月至9月死胎率較高的階段。

1.2 主要試劑

PRRSV/CSFV/PRV/PCV-2四重熒光定量PCR試劑盒，購自湖南國策生物技術有限公司，生產批號：382021006。PCV-3熒光定量PCR試劑盒，生產批號20220425；PPV熒光定量PCR試劑盒，生產批號：20220327；DNA/RNA總核酸提取試劑盒，生產批號：2022060201A，以上購自百獅園動物保健科技有限公司。

1.3 樣品采集

1.3.1 初乳乳房拭子

根據豬場的生產操作流程要求，母豬分娩前，使用1∶400的衛可溶液，對母豬乳房進行擦拭消毒。乳房拭子的采集于母豬分娩結束時，使用一次性滅菌棉簽，對母豬的乳房、乳頭進行擦拭，并通過使用棉簽按壓母豬乳頭，盡可能沾取到初乳乳汁，以4窩母豬初乳乳房拭子為1個混樣組，然后裝入到滅菌離心管中。標號做好記錄，放入帶冰塊的泡沫箱中，低溫配送至實驗室。在采集的每一份乳房拭子中加入3 mL PBS，渦旋震蕩30 s后，使用冷凍離心機于4 ℃條件下，6 000 r/min離心1 min，然后取上清液(注意避免收集到最上層的脂質層)分裝到2 mL滅菌離心管中，置于-20 ℃冰箱保存備用，或當天檢測。

1.3.2 睪丸處理液

根據豬場的生產操作流程，對3～5日齡的哺乳仔豬進行閹割。操作人員每閹割完1窩仔豬需要換刀片和手套，防止樣品間的交叉污染。將睪丸收納桶內套入滅菌處理過的一次性塑料袋，然后再使用一次性滅菌紗布套在塑料袋內，并用橡膠圈在桶口處勒緊，收集的睪丸組織放入紗布中，讓液體通過過濾紗布流入塑料袋內。以4窩仔豬睪丸為1個混樣組，收集完畢后可以稍微擠壓紗布，讓處理液充分過濾到塑料袋內。最后將塑料袋中的處理液轉移到滅菌離心管中，標號做好記錄，放入帶冰塊的泡沫箱中，配送至實驗室于-20 ℃冰箱保存或直接檢測。

1.4 DNA/RNA總核酸提取

分別取前期預處理好的乳房拭子樣品和睪丸處理液樣品各200 μL，各加入20 μL蛋白酶K混勻靜置60 s后，再加入到全自動DNA/RNA總核酸提取試劑盒指定的樣品孔中，放入全自動核酸提取儀器中，按照試劑盒說明書所示的步驟設置核酸提取程序，進行DNA/RNA總核酸提取，提取好的核酸置于-20 ℃冰箱，用作后續的qPCR檢測。

1.5 病原檢測

1.5.1 PRRSV/CSFV/PRV/PCV-2四重熒光定量PCR檢測

按照試劑盒說明書配置反應體系：PCR反應液43 μL，酶混合液2 μL，樣品核酸模板5 μL，合計50 μL進行qPCR擴增。選擇FAM通道檢測PRRSV核酸，HEX通道檢測PRV核酸，ROX通道檢測CSFV核酸，CY5通道檢測PCV-2核酸。反應程序：50 ℃ 30 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。結果判定標準：Ct值>40為陰性，Ct值≤35為陽性，35

1.5.2 PCV-3熒光定量PCR檢測

分別按照試劑盒的說明書配置反應體系：PCR反應液19 μL，酶混合液1 μL，樣品核酸模板5 μL，合計25 μL進行qPCR擴增。選擇FAM通道檢測PCV-3基因，選擇HEX通道為內參基因。反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，共40個循環。結果判定標準：Ct值>40為陰性，Ct值≤37為陽性，37

1.5.3 PPV熒光定量PCR檢測

按照試劑盒的說明書配置反應體系：PCR反應液19 μL，酶混合液1 μL，樣品核酸模板5 μL，合計25 μL進行qPCR擴增。選擇FAM通道檢測PPV基因，選擇HEX通道為內參基因。反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，共40個循環。結果判定標準：Ct值>40為陰性，Ct值≤37為陽性，37

1.6 數據統計與分析

對本次初乳乳房拭子與仔豬睪丸處理液中6種豬繁殖障礙相關病毒的抗原檢出率，使用卡方檢驗進行顯著性分析。對qPCR檢測初乳乳房拭子和睪丸處理液陽性樣本的Ct值，用IBM SPSS Statistics 21.0軟件獨立樣本t檢驗進行差異分析。P<0.05判為顯著差異，P<0.01判為差異極顯著。

2 結果

2.1 對隨機采樣的初乳乳房拭子和睪丸處理液的檢測

使用四重qPCR對113份混合初乳乳房拭子和171份混合睪丸處理液樣本進行檢測，結果顯示：PRRSV、CSFV、PRV和PCV-2在113份混合初乳乳房拭子和171份混合睪丸處理液樣本中的檢出率為0，與該場的歷史檢測監測記錄相吻合。PCV-3在113份混合初乳乳房拭子的檢出陽性數為30份，陽性率為26.55%；在171份混合睪丸處理液樣品檢出的陽性數為10份，陽性率為5.85%。PPV在113份混合初乳乳房拭子的檢出陽性數為5份，陽性率為4.42%；在171份混合睪丸處理液樣品檢出的陽性數為2份，陽性率為1.17%。初乳乳房拭子對PCV-3和PPV分別在檢出率分別比睪丸處理液高20.70個百分點(P<0.01)和3.26個百分點(P<0.05)，說明初乳乳房拭子對PCV-3和PPV檢出率要顯著高于睪丸處理液，詳見表1。

表1 6種豬繁殖障礙性相關病毒在隨機采樣的初乳乳房拭子和睪丸處理液中的檢測結果

2.2 對38頭1胎母豬的初乳乳房拭子和對應仔豬睪丸處理液的檢測

qPCR檢測結果顯示：PRRSV、CSFV和PRV在38頭母豬的初乳乳房拭子和對應仔豬睪丸處理液中檢出率均為0；PCV-2在初乳乳房拭子中的檢出率為2.63%(1/38)，在仔豬睪丸處理液中未檢出。PCV-3在初乳乳房拭子和對應仔豬睪丸處理液的檢出率分別為55.26%(21/38)和44.74%(17/38)，即PCV-3在初乳乳房拭子中的檢出率比仔豬睪丸處理液高10.52個百分點(P<0.01)。其中在21頭初乳乳房拭子為PCV3陽性母豬中，有16頭對應的仔豬睪丸處理液也為陽性，其余5頭對應的仔豬睪丸處理液樣品檢測為陰性，皮爾遜相關性檢驗結果為相關性顯著(r=0.618，P<0.01)；有1份PCV-3陽性仔豬睪丸處理液樣品未在其對應的初乳乳房拭子樣品中檢測到PCV-3，占比2.63%(1/38)。PPV在38份初乳乳房拭子樣品中檢出1份，陽性率為2.63%(1/38)，在仔豬睪丸處理液樣品中未檢出。PCV-2+PCV-3和PPV+PCV-3混合感染在初乳乳房拭子樣品中的檢出率均為2.63%(1/38)，在睪丸處理液樣品中均未檢測到任何形式的混合感染。詳見表2和圖1。

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。下同。

表2 38頭1胎母豬初乳乳房拭子及睪丸處理液樣品檢測數據(Ct值)比較

PCV-3的qPCR檢測結果顯示(圖2)，睪丸處理液陽性樣品的平均Ct值為25.36，初乳乳房拭子陽性樣品的平均Ct值為29.54，即睪丸處理液樣品的平均Ct值要顯著低于初乳乳房拭子樣品(P<0.05)。

圖2 PCV-3 陽性樣本qPCR的Ct值

3 討論

ASFV、PRRSV、PRV、CSFV、PCV-2、PCV-3和PPV等是引起豬繁殖障礙性疾病的重要病原，給養豬業帶來巨大的經濟損失[7-9]。ASFV在中國暴發后，不少規模豬場自建檢測實驗室[10]，使得這些豬場重點關注疾病的檢測監測變得更加便捷。然而隨著豬繁殖障礙性疾病在臨床上的感染類型逐漸變得復雜多樣化，除急性和慢性發病外，隱性感染、亞臨床感染和間歇性排毒呈逐步上升趨勢，使得臨床監測的敏感性和準確性受到巨大的挑戰。如Batista 等[11]報道了PRRSV血清樣本抗原抗體檢測均為陰性的豬，仍然能在其內臟器官和組織檢測到病原。

當前，對豬群重點防控疫病監測的主要樣品類型是血清、扁桃體拭子、臍帶血、口腔液和環境樣。對于血清樣本，在低感染率下對大多數疾病的檢測敏感性低[12]，且血清的采集需要多人配合綁定豬只，樣品采集效率低。同樣，扁桃體拭子的采集也需要多人配合，且使用專用工具對豬進行綁定，才能高效準確地采集到扁桃體拭子樣品[2]，高人力成本導致其很難規模化用于疫病的長期監測。臍帶血樣本近年來也在豬場廣泛應用于多種垂直傳播疾病的監測[13-14]，但多種垂直傳播性病原，如PRRSV，經垂直傳播感染胎兒是隨機的[15]，導致即使存在垂直傳播，也并非在所有仔豬臍帶血都能檢測到病毒，所以臨床上需要盡可能采集到窩內所有仔豬的臍帶血才可提高結果可信度，由于母豬的產程分布較長，特別是晚上在無人接產的情況下，并不能采集到窩內所有初生仔豬的臍帶血。口腔液樣品在臨床上用于病原的抗原診斷和監測時，對大欄群體飼養的豬群采樣效果較好，但也會出現豬不來咀嚼咬繩的情況，導致檢測結果的敏感性受到限制[16]；其次對于限位欄飼養的母豬，特別是產房母豬，豬不咀嚼咬繩的概率較高，因此在某些臨床情景下，采集口腔液的效率和便利性甚至不如扁桃體拭子。而對于環境樣品，樣品中雜質，如飼料殘渣、糞尿、強酸強堿等環境消毒劑殘留，均會影響核酸提取的效果和抑制PCR反應，導致檢出率大大下降[17]。綜上所述，以上樣品并不適合作為長期疫病監測的高敏和高效樣品來源。

豬場獸醫和管理者一直在不斷摸索更為敏感、便捷的樣品采集方法。近年來出現一種新的樣品采集方法，即睪丸處理液。睪丸液是在仔豬閹割或斷尾時采集的組織滲出液的混合樣品，又被稱為“處理液”，可作為PRRSV的高敏感樣品[18]，且其采樣便捷能滿足豬場一線工作者的需求，但目前關于睪丸處理液對PCV-3、PPV等病毒的檢測報道較少。另外對于母豬初乳乳房拭子，有研究顯示在沒有PCV-3病毒血癥的分娩母豬中，也能在初乳中檢測到高病毒載量的PCV-3[19]；Ha等[20]同樣報道了初乳和乳汁中的PCV-2和PPV具備傳染性。初乳具備這一特點的原因是在初乳期，母豬乳腺腺泡周圍的上皮細胞之間連接不再緊密，引起滲出物從血漿滲出至乳汁，且在此階段大量淋巴細胞歸巢至乳腺，使母豬初乳中含有高含量的白細胞[21]。這些白細胞通過“木馬機制”進行相關病原的垂直傳播，以ASFV為例，靶細胞表明因具有抗體(IgG)的Fc受體而具有調理吞噬作用，從而給藏匿于病毒-抗體復合物中的病毒以可乘之機，進入靶細胞，登革熱病毒也有類似的病毒傳播機制[22-23]，提示初乳樣品具備對某些病原的高效監測能力，且母豬初乳乳房拭子的采集方便性極高，能大大減少工作人員的工作量。

本研究結果顯示，在對隨機不分胎次采集的113份混合初乳乳房拭子和171份混合仔豬睪丸處理液樣本的6種垂直傳播性疾病的病原檢測中，初乳乳房拭子樣本中PCV-3和PPV的檢出率比仔豬睪丸處理液樣本分別顯著高出20.7個百分點和3.25個百分點。由于本次試驗所研究的豬場1胎母豬的年平均死胎率顯著高于其他胎次，結合豬場實際生產情況，遂額外再單獨采集38份1胎母豬初乳乳房拭子樣本和對應的仔豬睪丸處理液樣本進行6種垂直傳播性疾病的病原檢測分析。結果顯示，初乳乳房拭子樣本中PCV-2、PCV-3和PPV的檢出率分別比仔豬睪丸處理液樣本分別高出2.63個百分點、10.52個百分點和2.63個百分點。有1份仔豬睪丸處理液樣品檢出PCV-3，但未在其對應的初乳乳房拭子中檢測到PCV-3，占比2.63%，可能是仔豬出生后的自然感染導致，后續可通過ELISA等方法來進一步研究。其次，基于這一差異，提示豬場獸醫可以通過比較初乳乳房拭子和睪丸處理液樣本中的檢測差異，來評估病毒垂直傳播和水平傳播的程度和差異。PCV-2+PCV-3和PPV+PCV-3的雙重感染在初乳乳房拭子樣本中的檢出率均為2.63%，但在仔豬睪丸處理液中未見任何形式的混合感染。以上數據顯示，初乳乳房拭子樣本比仔豬睪丸處理液樣本對PCV-2、PCV-3和PPV具備更高的檢測敏感性。在qPCR檢測PCV-3陽性的21份初乳乳房拭子中和17份睪丸處理液中，仔豬睪丸處理液樣品的平均Ct值要顯著低于初乳乳房拭子，其可能的原因是病毒經母豬初乳傳播給仔豬，并在仔豬體內進行復制和增殖，即導致仔豬血液和睪丸處理液中呈現更高的病毒載量。

單獨檢測的38頭1胎母豬的初乳乳房拭子和對應仔豬睪丸處理液樣本中PCV-3檢出率均要遠高于各胎次母豬的隨機混合樣品，Kedkovid等[19]也報道了PCV-3在1胎母豬初乳中檢出率要顯著高于其他胎次。有文獻報道[24-25]，PCV-3在死胎有較高的檢出率，而本場1胎母豬的死胎率顯著高于其他胎次母豬，是否與PCV-3的感染有直接關系值得更進一步研究。 PRRSV、CSFV和PRV在本次研究中在初乳乳房拭子和睪丸處理液中的檢出率均為0，結合本場的歷史檢測監測記錄及豬群的臨床表現，較為吻合。本次研究并未能比較出初乳乳房拭子和仔豬睪丸處理液對PRRSV、CSFV和PRV的檢測敏感性，其次所采集的113份初乳乳房拭子混合樣品與171份仔豬睪丸液混合樣品并不對應匹配，即在臨床對多種豬繁殖障礙相關病毒的監測中，初乳乳房拭子是否能完全取代睪丸處理液，后續需要通過對不同胎次母豬的初乳乳房拭子和對應的仔豬睪丸處理液進行更進一步研究。

以上結果表明，母豬初乳乳房拭子樣品對PCV-2、PCV-3和PPV具備較高的監測能力，且檢出率要高仔豬睪丸處理液樣本，但兩者對PRRSV、CSFV和PRV的檢測敏感性差異未能比較。臨床上，母豬初乳乳房拭子的預警時間要早于仔豬睪丸處理液，通過初乳乳房拭子監測到相關疫病后，可以通過減少仔豬的寄養來降低病毒的水平傳播程度；其次，也能提示豬場獸醫及時采取生物安全和免疫保健方案來降低病原的危害，對豬場疫病防控起到極大的預警作用。綜上，母豬初乳乳房拭子樣品作為PCV-2、PCV-3和PPV的監測樣本，具備高檢測敏感性、采樣便利性和風險預警性，能準確地反映產房內母豬和仔豬病原流行情況及風險，以便豬場制定和采取更為準確的免疫保健和生物安全等綜合防控措施。