胃癌預(yù)后及免疫治療反應(yīng)預(yù)測基底膜相關(guān)基因標(biāo)簽的構(gòu)建

李文倩 宮宇紅 邱文生

[摘要] 目的 構(gòu)建一種新的能夠預(yù)測胃癌病人預(yù)后、腫瘤免疫微環(huán)境以及免疫治療反應(yīng)的基因標(biāo)簽。方法采用生物信息學(xué)方法從61個基底膜（BM）相關(guān)基因中篩選出6個關(guān)鍵基因，構(gòu)建BM相關(guān)的基因標(biāo)簽。利用該標(biāo)簽將胃癌病人分為高、低風(fēng)險組進(jìn)行預(yù)后、腫瘤免疫微環(huán)境以及免疫治療反應(yīng)分析；將臨床風(fēng)險因素與基因標(biāo)簽所得風(fēng)險評分結(jié)合構(gòu)建列線圖模型并進(jìn)行驗證。結(jié)果 低風(fēng)險組胃癌病人表現(xiàn)出更長的總生存期，較少的抑制性免疫細(xì)胞浸潤，較低的基質(zhì)評分，相對較低的腫瘤免疫功能障礙與排斥值，以及更高的免疫治療反應(yīng)，提示低風(fēng)險組更有可能從免疫治療中獲益。列線圖模型的總生存預(yù)測準(zhǔn)確度較高，區(qū)分度及臨床適用性也均高于其他風(fēng)險因素，這一結(jié)果在驗證集中得到了驗證。結(jié)論 構(gòu)建了一種新的基于BM的基因標(biāo)簽，該標(biāo)簽對于評估胃癌病人預(yù)后、腫瘤免疫微環(huán)境以及免疫治療反應(yīng)均具有重要意義。

[關(guān)鍵詞] 胃腫瘤；基膜；基因；預(yù)后；腫瘤微環(huán)境；免疫療法

[中圖分類號] R735.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2023）04-0527-08

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.126

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230921.1132.002;2023-09-22 10：52：53

CONSTRUCTION OF BASEMENT MEMBRANE-RELATED GENE SIGNATURE FOR PREDICTING PROGNOSIS AND RESPONSE TO IMMUNOTHERAPY IN GASTRIC CANCER LI Wenqian， GONG Yuhong， QIU Wensheng （Department of Medical Oncology， Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266031， China）＼; [ABSTRACT] Objective To construct a new gene signature that can predict the prognosis， tumor immune microenvironment， and response to immunotherapy in patients with gastric cancer. Methods The bioinformatics method was used to screen for six key genes from 61 basement membrane （BM）-related genes for the construction of a BM-related gene signature. The signature was used to classify patients with gastric cancer into high- and low-risk groups for analysis of prognosis， tumor immune microenvironment， and response to immunotherapy. A nomogram model was constructed by combining clinical risk factors with risk scores derived from the gene signature. Results Patients with gastric cancer in the low-risk group showed longer overall survi-val， less infiltration of inhibitory immune cells， lower stromal scores， relatively low tumor immune dysfunction and exclusion va-lues， and increased response to immunotherapy， indicating that the low-risk group may be more likely to benefit from the immunotherapy. The nomogram model showed relatively high accuracy in predicting overall survival， with higher differentiation and clinical applicability than other risk factors， which was validated in the validation set. Conclusion A novel BM-related gene signature is constructed， which is of great significance for evaluating the prognosis， tumor immune microenvironment， and response to immunotherapy in patients with gastric cancer.

[KEY WORDS] stomach neoplasms; basement membrane; genes; prognosis; tumor microenvironment; immunotherapy

胃癌是全球發(fā)病率排第5、死亡率排第3的惡性腫瘤^[1]。在過去的幾年中，免疫療法在提高胃癌病人的總生存期（OS）方面被證明是有效的^[2]。然而，由于胃癌的高度異質(zhì)性，免疫療法并不適用于所有胃癌病人^[3]。因此，開發(fā)能夠準(zhǔn)確預(yù)測胃癌腫瘤免疫微環(huán)境的基因標(biāo)簽，以識別不同的胃癌免疫亞型，確定最有可能從免疫治療中獲益的人群，是目前亟待解決的問題。在腫瘤組織中，免疫細(xì)胞浸潤的程度受腫瘤周圍毛細(xì)血管通透性、腫瘤刺激產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子以及腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞外基質(zhì)的影響^[4]。作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，基底膜（BM）在免疫細(xì)胞浸潤過程中充當(dāng)重要屏障^[5]。然而，BM相關(guān)分子是否能夠影響免疫細(xì)胞浸潤從而調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境仍然未知。此外，BM作為浸潤性癌和原位癌區(qū)分的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用^[6]。目前尚無研究探討B(tài)M相關(guān)分子對胃癌預(yù)后的影響。本研究基于生物信息學(xué)方法對以上問題進(jìn)行了初步探討。

1 材料和方法

1.1 BM相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的采集

從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中獲取32例正常樣本及375例胃癌樣本的RNA測序數(shù)據(jù)和臨床信息作為訓(xùn)練集，再從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）GSE84437數(shù)據(jù)集中獲取433例胃癌樣本的RNA測序數(shù)據(jù)和臨床信息作為驗證集。從基因集富集分析（GSEA）分子特征數(shù)據(jù)庫（v7.5.1版本）中獲取61個BM相關(guān)基因。

1.2 與胃癌預(yù)后相關(guān)的BM相關(guān)基因標(biāo)簽的構(gòu)建及驗證

用“l(fā)imma”R包分析腫瘤和正常組織間差異表達(dá)的BM相關(guān)基因（BMDEGs），將|log₂FC|＞1和偽發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05作為閾值。訓(xùn)練集采用單變量比例風(fēng)險回歸（Cox回歸）分析篩選胃癌預(yù)后相關(guān)的BM相關(guān)候選基因，進(jìn)一步使用最小絕對值選擇與收縮算子（LASSO）回歸建立提示胃癌預(yù)后的BM相關(guān)基因標(biāo)簽。根據(jù)標(biāo)簽中每個BM相關(guān)基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平與其相應(yīng)回歸系數(shù)的乘積再總和來計算每例病人的風(fēng)險評分。根據(jù)中位風(fēng)險評分將訓(xùn)練集和驗證集的病人分為高、低風(fēng)險組，采用生存曲線（Kaplan-Meier曲線）分析評估兩組生存差異，Cox回歸及受試者工作特征（ROC）曲線分析進(jìn)一步驗證標(biāo)簽的可靠性和穩(wěn)定性。用“rms”R包構(gòu)建列線圖，預(yù)測胃癌病人1、3、5年的OS。建立校準(zhǔn)曲線以評估使用列線圖預(yù)測的OS與實際觀察到的OS之間的一致性，采用ROC曲線分析比較各預(yù)測變量的預(yù)后價值，采用決策曲線分析（DCA）評估列線圖模型的臨床適用性。

1.3 腫瘤免疫微環(huán)境及免疫治療反應(yīng)分析

采用不同算法評估高、低風(fēng)險組胃癌病人腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的豐度，同時分析兩組間免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因表達(dá)、免疫功能、基質(zhì)評分、免疫評分以及腫瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）的差異。從腫瘤免疫功能障礙和排斥（TIDE）在線網(wǎng)站（http：//tide.dfci.harvard.edu/）下載胃癌免疫治療反應(yīng)相關(guān)數(shù)據(jù)信息，計算高、低風(fēng)險組病人的TIDE評分，并利用GSE78220和PRJEB25780數(shù)據(jù)集信息分析風(fēng)險評分與免疫治療反應(yīng)的關(guān)系。然后用“pRRophetic”R包分析風(fēng)險評分與胃癌常用化療藥物敏感性之間的關(guān)系。

1.4 在線生信分析工具驗證BMDEGs的表達(dá)

基于基因表達(dá)水平交互式分析平臺（GEPIA）（http：//gepia.cancer-pku.cn/detail.php）驗證胃癌和正常胃組織中BMDEGs的差異表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.1軟件（GraphPad Software，Inc.）和R 4.1.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。連續(xù)變量比較采用Students t檢驗、獨(dú)立樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗、Kruskal-Wallis檢驗和方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BM相關(guān)基因標(biāo)簽的構(gòu)建

差異分析篩選出19個BMDEGs（圖1A、B）。用單變量Cox回歸分析進(jìn)一步篩選出8個與胃癌預(yù)后相關(guān)的BMDEGs（圖1C），通過LASSO回歸分析最終建立了由6個BMDEGs（CAV1、COL4A1、MMP11、PXDN、COL4A5、USH2A）組成的胃癌基因標(biāo)簽（圖1D、E）。

2.2 BM相關(guān)基因標(biāo)簽預(yù)后價值的評估

病人的風(fēng)險評分計算如下：風(fēng)險評分=0.072×CAV1的表達(dá)+0.015×COL4A1的表達(dá)+0.077×MMP11的表達(dá)+0.152×PXDN的表達(dá)+0.054×COL4A5表達(dá)+1.188×USH2A表達(dá)。訓(xùn)練集（圖2A）和驗證集（圖2B）中的病人均根據(jù)中位風(fēng)險評分分為高、低風(fēng)險組。訓(xùn)練集和驗證集中風(fēng)險評分較高的胃癌病人往往死亡較早，Kaplan-Meier曲線分析表明，高風(fēng)險組胃癌病人的OS較短（圖2C～F）。訓(xùn)練集單變量Cox回歸分析表明，年齡和T、N、M分期以及風(fēng)險評分（P＜0.001，HR=3.472，95%CI=1.949～6.186）與OS之間顯著相關(guān)（圖2G）；多變量Cox回歸分析同樣顯示，年齡和N、M分期以及風(fēng)險評分（P＜0.001，HR=4.008，95%CI=2.193～7.323）是OS的獨(dú)立預(yù)后因素（圖2H）。驗證集的單變量和多變量Cox回歸分析進(jìn)一步證實了訓(xùn)練集的結(jié)果（圖2J、K）。以上結(jié)果證明我們構(gòu)建的BM相關(guān)基因標(biāo)簽可作為胃癌病人的獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物。ROC曲線分析結(jié)果顯示，訓(xùn)練集中預(yù)測胃癌病人1、3、5年生存率的風(fēng)險評分曲線下面積（AUC）分別為0.627、0.638和0.717（圖2I），驗證集中預(yù)測1、3、5年生存率的風(fēng)險評分AUC也均高于0.6（圖2L）。

2.3 預(yù)測胃癌OS的列線圖模型的構(gòu)建及評價

將多種臨床風(fēng)險因素與基于基因標(biāo)簽計算所得風(fēng)險評分結(jié)合構(gòu)建胃癌OS預(yù)測的列線圖模型（圖3A）。訓(xùn)練集及驗證集的校準(zhǔn)曲線顯示，列線圖模型預(yù)測胃癌病人OS的準(zhǔn)確度較高（圖3B、C）。兩隊列ROC曲線分析結(jié)果顯示，列線圖模型預(yù)測胃癌病人1、3、5年OS的AUC均較風(fēng)險評分高（圖3D、G），更顯著高于其他臨床風(fēng)險因素（圖3E、H）。DCA結(jié)果顯示，列線圖模型預(yù)測胃癌OS的臨床適用度也較高（圖3F、I）。

2.4 腫瘤免疫微環(huán)境與免疫治療反應(yīng)分析

免疫細(xì)胞浸潤與風(fēng)險評分間關(guān)系分析結(jié)果顯示，大多數(shù)免疫細(xì)胞浸潤水平與風(fēng)險評分呈正相關(guān)，尤其是促進(jìn)胃癌進(jìn)展和導(dǎo)致免疫抑制的細(xì)胞（圖4A）。箱線圖結(jié)果亦是如此（圖4B）。免疫功能差異分析結(jié)果顯示，趨化因子CCR家族、抗原遞呈細(xì)胞（APC）共刺激、Ⅱ型干擾素反應(yīng)功能在高風(fēng)險組中更強(qiáng)，而主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類功能在低風(fēng)險組中更強(qiáng)（圖4C）。免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因（ICGs）表達(dá)差異情況分析顯示，高風(fēng)險組中有22個基因表達(dá)水平顯著增加，而低風(fēng)險組中僅有4個基因（圖4D）。計算兩組腫瘤純度（ESTIMATE）評分、免疫評分和基質(zhì)評分結(jié)果顯示，高風(fēng)險組3種評分均顯著高于低風(fēng)險組（圖4E、F、G）。上述結(jié)果表明，高風(fēng)險組胃癌病人可能通過促進(jìn)免疫抑制細(xì)胞浸潤，ICGs表達(dá)增加，以及募集更多基質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)免疫逃逸，從而導(dǎo)致預(yù)后不良。

MSI分析結(jié)果顯示，MSI-H的病人風(fēng)險評分更低（圖5A）；TIDE分析結(jié)果顯示，高風(fēng)險組病人的TIDE評分更高（圖5B）。利用GSE78220（圖5C）及PRJEB25780（帕博利珠單抗治療反應(yīng)，圖5D）免疫治療反應(yīng)數(shù)據(jù)集分析風(fēng)險評分與免疫治療反應(yīng)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，免疫治療有反應(yīng)組風(fēng)險評分更低。表明高風(fēng)險組胃癌病人更容易發(fā)生免疫逃逸，且對免疫治療的反應(yīng)更有限。常用化療藥物敏感性差異分析結(jié)果顯示，高風(fēng)險組對硼替佐米、環(huán)巴胺以及帕唑帕尼的敏感性更高（圖5E～G），而低風(fēng)險組則對甲氨蝶呤和絲裂霉素C更敏感（圖5H、I）。以上結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的BM相關(guān)基因標(biāo)簽有助于臨床管理和減少胃癌病人耐藥的發(fā)生。

2.5 6個BMDEGs表達(dá)水平的驗證

GEPIA分析結(jié)果顯示，胃癌組織中COL4A1、PXDN和MMP11的表達(dá)水平顯著高于正常組織，而COL4A5的表達(dá)水平則顯著低于正常組織，但與先前研究不同的是，CAV1和USH2A在胃癌與正常組織中的表達(dá)差異無顯著性。

3 討論

BM作為腫瘤進(jìn)展和腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)中至關(guān)重要的結(jié)構(gòu)，目前還沒有研究探索其相關(guān)分子在胃癌預(yù)后、腫瘤免疫微環(huán)境以及胃癌免疫治療中的作用。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫，從61個BM相關(guān)基因中篩選出19個在胃癌及癌旁組織中差異表達(dá)的基因，進(jìn)一步采用單變量Cox和LASSO回歸進(jìn)行預(yù)后分析，最后構(gòu)建了一個包含6個關(guān)鍵BMDEGs的基因標(biāo)簽，該標(biāo)簽可對胃癌病人生存風(fēng)險進(jìn)行評分，評估病人預(yù)后，分析腫瘤免疫微環(huán)境，可作為評估胃癌免疫治療效果的有效分子生物標(biāo)志物。該標(biāo)簽所包含的6個關(guān)鍵基因目前已被證明會影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

CAV1是洞穴的主要支架蛋白，研究發(fā)現(xiàn)它在胃癌組織中低表達(dá)，增加其表達(dá)可抑制胃癌發(fā)展^[7]。COL4A1是Ⅳ型膠原蛋白α鏈（COL4A）家族的成員，可通過調(diào)節(jié)Hedgehog信號通路影響胃癌侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，有助于胃癌轉(zhuǎn)移^[8]。COL4A5同屬于COL4A家族，生存分析表明，COL4A1/5表達(dá)百分比越低，胃癌病人的OS越長，且COL4A5是胃癌的獨(dú)立預(yù)后分子標(biāo)志物^[9]。MMP11作為基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）家族的一員，在胃癌病人腫瘤組織和血漿純化的外泌體中過表達(dá)，參與胃癌轉(zhuǎn)移，影響胃癌OS^[10]。PXDN催化膠原蛋白Ⅳ中的磺酰胺鍵，起鞏固BM的作用，研究發(fā)現(xiàn)PXDN可抑制宮頸癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化^[11]，但可促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞侵襲^[12]。USH2A編碼Usherin蛋白，研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在胃癌的早期階段表達(dá)水平升高，可能與促進(jìn)胃癌的進(jìn)展有關(guān)^[13]。以上文獻(xiàn)結(jié)果增加了本研究構(gòu)建的基因標(biāo)簽預(yù)測胃癌病人預(yù)后的可靠性。

此外，本研究還結(jié)合多種臨床風(fēng)險因素與基于基因標(biāo)簽所得的風(fēng)險評分構(gòu)建了一個能夠更為準(zhǔn)確預(yù)測胃癌OS的列線圖模型，并從3個維度評估了列線圖模型預(yù)測胃癌OS的臨床價值。結(jié)果顯示，列線圖模型預(yù)測胃癌OS的準(zhǔn)確度、區(qū)分度以及臨床適用度均較高。

通過對BM相關(guān)分子與腫瘤免疫微環(huán)境的相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，高風(fēng)險組中免疫細(xì)胞浸潤度較高，且浸潤的免疫細(xì)胞多與腫瘤發(fā)展和抗腫瘤免疫抑制相關(guān)，如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。此外，高風(fēng)險組基質(zhì)細(xì)胞評分以及ICGs的表達(dá)均較高，這進(jìn)一步促進(jìn)了高風(fēng)險組免疫逃逸的發(fā)生。

過去10年中，免疫檢查點(diǎn)阻斷療法已使一系列惡性腫瘤獲得令人振奮的生存獲益。目前我國已批準(zhǔn)納武利尤單抗聯(lián)合化療（CapeOX/FOLFOX）用于晚期胃癌一線治療，無論P(yáng)D-L1的表達(dá)如何。信迪利單抗聯(lián)合CapeOX也已在我國被批準(zhǔn)用于晚期胃癌一線治療。此外尚有一些在其他腫瘤中獲批的PD-1單抗對晚期胃癌的療效目前也在研究中。同時，國內(nèi)也有一大批PD-1抑制劑用于胃癌術(shù)前新輔助治療的二期臨床研究正在進(jìn)行，目前安全性基本沒有問題。免疫治療的日益成熟應(yīng)用將對早晚期胃癌病人的生存及生活質(zhì)量起到明顯改善作用。

TCGA根據(jù)胃癌分子及遺傳特征將胃癌分為4種亞型：EB病毒陽性型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型、染色體不穩(wěn)定型和基因組穩(wěn)定型^[14]。其中EB病毒陽性型胃癌表現(xiàn)出高CD8陽性T細(xì)胞浸潤和PD-L1/L2表達(dá)增加，提示其對免疫檢查點(diǎn)抑制劑具有更高的敏感性^[15]。MSI-H狀態(tài)是手術(shù)完全可切除胃癌病人的良好預(yù)后因素，是圍手術(shù)期細(xì)胞毒性化療（如氟尿嘧啶類）反應(yīng)的陰性預(yù)測指標(biāo)，也是免疫檢查點(diǎn)抑制劑反應(yīng)的陽性預(yù)測因子。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南推薦對所有新確診為胃癌的病人使用聚合酶鏈反應(yīng)、二代測序或免疫組化方法進(jìn)行MSI狀態(tài)檢測（https：//www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/gastric.pdf）。此外，腫瘤突變負(fù)荷以及PD-L1表達(dá)均是免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療晚期胃癌療效的有用預(yù)測生物標(biāo)志物。本研究采用生物信息學(xué)方法構(gòu)建了一個新的可預(yù)測胃癌免疫微環(huán)境及免疫治療反應(yīng)的BM相關(guān)基因標(biāo)簽，通過TIDE及其他免疫治療反應(yīng)數(shù)據(jù)庫分析，結(jié)果表明該基因標(biāo)簽?zāi)軌蚝芎玫仡A(yù)測胃癌抗PD-1治療反應(yīng)。

總之，本研究首次將BM與胃癌預(yù)后、腫瘤免疫微環(huán)境和免疫治療反應(yīng)評估聯(lián)系起來，隨著二代測序技術(shù)的成熟應(yīng)用，本研究結(jié)果有望使胃癌的免疫治療、分子靶向治療及化療更加個體化和精準(zhǔn)化。

[參考文獻(xiàn)]

[1]SMYTH E C， NILSSON M， GRABSCH H I， et al. Gastric cancer[J]. Lancet， 2020，396（10251）：635-648.

[2]LI K X， ZHANG A， LI X Y， et al. Advances in clinical immunotherapy for gastric cancer[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-Reviews on Cancer， 2021，1876（2）：188615.

[3]JOSHI S S， BADGWELL B D. Current treatment and recent progress in gastric cancer[J]. CA： a Cancer Journal for Clinicians， 2021，71（3）：264-279.

[4]COUSSENS L M， WERB Z. Inflammation and cancer[J]. Nature， 2002，420（6917）：860-867.

[5]MADSEN C D， SAHAI E. Cancer dissemination—lessons from leukocytes[J]. Developmental Cell， 2010，19（1）：13-26.

[6]CHANG J L， CHAUDHURI O. Beyond proteases： basement membrane mechanics and cancer invasion[J]. The Journal of Cell Biology， 2019，218（8）：2456-2469.

[7]LUO Z， RONG Z Y， ZHANG J M， et al. Circular RNA circCCDC9 acts as a miR-6792-3p sponge to suppress the progression of gastric cancer through regulating CAV1 expression[J]. Molecular Cancer， 2020，19（1）：86.

[8]CUI X J， SHAN T， QIAO L N. Collagen type Ⅳ alpha 1 （COL4A1） silence hampers the invasion， migration and epithelial-mesenchymal transition （EMT） of gastric cancer cells through blocking Hedgehog signaling pathway[J]. Bioengineered， 2022，13（4）：8972-8981.

[9]ZENG X， WANG H Y， WANG Y P， et al. COL4A family： potential prognostic biomarkers and therapeutic targets for gastric cancer[J]. Translational Cancer Research， 2020，9（9）：5218-5232.

[10]XU G F， ZHANG B， YE J H， et al. Exosomal miRNA-139 in cancer-associated fibroblasts inhibits gastric cancer progression by repressing MMP11 expression[J]. International Journal of Biological Sciences， 2019，15（11）：2320-2329.

[11]SITOLE B N， MAVRI-DAMELIN D. Peroxidasin is regulated by the epithelial-mesenchymal transition master transcription factor Snai1[J]. Gene， 2018，646：195-202.

[12]JAYACHANDRAN A， PRITHVIRAJ P， LO P H， et al. Identifying and targeting determinants of melanoma cellular invasion[J]. Oncotarget， 2016，7（27）：41186-41202.

[13]REN C X， WU C L， WANG N N， et al. Clonal architectures predict clinical outcome in gastric adenocarcinoma based on genomic variation， tumor evolution， and heterogeneity[J]. Cell Transplantation， 2021，30：963689721989606.

[14]CANCER GENOME ATLAS RESEARCH NETWORK. Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma[J]. Nature， 2014，513（7517）：202-209.

[15]SASAKI S， NISHIKAWA J， SAKAI K， et al. EBV-associa-ted gastric cancer evades T-cell immunity by PD-1/PD-L1 inte-ractions[J]. Gastric Cancer： Official Journal of the Internatio-nal Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association， 2019，22（3）：486-496.

（本文編輯 馬偉平）