銀州柴胡根的發育解剖學研究

李 根,韓桂軍,李為民,李 斌,周亞福

(1 陜西省西安植物園[陜西省植物研究所],西安 710061;2 陜西省植物資源保護與利用工程技術研究中心,西安 710061)

銀州柴胡(BupleurumyinchowenseShan et Y. Li)隸屬于傘形科(Umbelliferae)柴胡屬,為多年生草本植物。藥用部位為干燥根,異名紅柴胡、紅軟柴胡、軟柴胡(陜西),臥銀花(陜西橫山)[1]。其主要有效成分為皂苷和揮發油等,具有和解退熱、疏肝解郁、升提中氣的功效[2]。

銀州柴胡作為柴胡類藥材的一種,其名稱的出現可追溯至宋代或更早。《本草圖經》中提及:“柴胡-銀夏出者獨勝”。《本草別說》亦稱:“柴胡-唯銀夏者最良”等[3]。可見在宋代-明代時期,銀州一帶所產的柴胡普遍為醫家所知,并被認為是品質優良的一類。西北傳統醫藥認為,銀州柴胡為柴胡中品質最佳品種,且銷售量較大,部分地區已將其列入地方標準。主要分布在陜西、寧夏、甘肅和內蒙等省區,是陜甘寧中藥柴胡主流品種之一[4]。銀州柴胡在陜西省有悠久的藥用歷史,在陜西北部作紅柴胡入藥。本課題組前期對柴胡屬5種藥用植物總皂苷和總黃酮含量進行了測定,發現銀州柴胡主要化學成分柴胡皂苷和總黃酮含量均較高,與藥典收錄的北柴胡和狹葉柴胡主要成分含量類似,表明銀州柴胡品質優良,具有很好的開發利用價值[5]。

為進一步合理開發和利用柴胡屬其他野生植物資源,很有必要對銀州柴胡這一優良種質進行深入系統研究。目前關于銀州柴胡的研究主要集中在有效成分的分離提取[2,5-8]、中藥鑒定[9-10]以及本草考證[11]等方面。本研究以銀州柴胡藥用部位根為研究對象,旨在揭示其藥用部位的發生發育特點,為柴胡屬藥用植物的分類鑒定及有效成分積累的研究等提供科學依據。

1 材料和方法

研究材料為傘形科柴胡屬銀州柴胡(BupleurumyinchowenseShan et Y. Li),采自陜西省咸陽市永壽縣(34°41′26.88″ N,108°8′40.92″ E),選取健康生長的銀州柴胡根作為試驗材料。

采用石蠟切片法對藥用植物銀州柴胡根進行發育解剖學研究。取銀州柴胡根尖、初生結構和次生結構的根,切割至3～5 mm的小段,浸入50%FAA固定液(V∶V,50%酒精∶冰醋酸∶甲醛=90∶5∶5)進行固定48 h[12]。經梯度酒精進行脫水(50%,70%,80%,95%,100%,100%酒精)后,二甲苯透明,石蠟包埋。使用Leica RM 2135旋轉切片機切片,厚度為7～12 μm。切片后經番紅-固綠染色與鐵礬-蘇木精染色[12]。Leica全自動熒光生物顯微鏡(Leica DM 3000 CCD:DFC7000 T)鏡檢并拍照。

2 結果與分析

2.1 根尖及其組織分化

研究對銀州柴胡根尖進行了橫切和縱切。結果表明,銀州柴胡的根尖從上到下分為:根冠、分生區、伸長區和成熟區(根毛區)4個部分(圖1,A)。根冠位于根尖的最先端,縱切面呈帽子狀;橫切面上根冠細胞總體上形狀不規則,均由薄壁細胞組成(圖1,B)。根冠最內方的細胞體積小,細胞核大而圓,細胞質濃厚;最外方的細胞體積較大,細胞核部分消失,液泡大而明顯(圖1,A)。分生區緊鄰根冠,位于根冠和伸長區之間即頂端分生組織,頂端分生組織由原分生組織(圖1,C)及其衍生的初生分生組織組成(圖1,D)。

A. 根尖縱切,示根冠、分生區、伸長區和成熟區;B. 根冠橫切;C. 原生分生組織;D. 原表皮外方的根冠組織、原表皮、皮層原以及中柱原;E. 表皮、皮層和維管柱以及原生韌皮部篩管;F. 熒光顯微照片,表皮、皮層和維管柱以及原生韌皮部篩管;G. 根初生結構,由表皮、皮層和維管柱組成;H. 熒光顯微照片,示內皮層凱氏帶以及表皮細胞明顯的徑向壁加厚。Co.皮層;CC.木栓形成層;CL.木栓層;CS.凱氏帶;EN.內皮層;EP.表皮;IC.皮層原;IS.中柱原;PE.中柱鞘;PP.原表皮;PPS.原生韌皮部篩管;PRP.原生韌皮部;PRX.原生木質部;RC.根冠;RWT.徑向壁加厚;S.中柱;SC.分泌道;SXF.次生木質部纖維;VS.維管形成層。

原分生組織細胞由未分化的細胞組成,其細胞體積小、等徑、排列緊密、細胞壁薄而細胞質濃厚、細胞核大而明顯且液泡極小,具有典型的分生組織的特點。初生分生組織位于原分生組織前后方,由原分生組織細胞的衍生細胞組成,其組織細胞已開始分化,細胞體積增大且呈長方形,細胞質逐漸變薄,液泡體積增大。

在縱切片上,銀州柴胡根初生分生組織由根冠原、表皮原、皮層原和中柱原四部分組成(圖1,A)。根冠原位于原分生組織上方,是根冠最內方的細胞群,其分化產生根冠(圖1,B)。從橫切面上,表皮原位于根初生分生組織的最外方,由一層排列緊密且整齊的細胞組成,細胞體積小而呈矩形,細胞質濃厚(圖1,D)。皮層原位于表皮原的下方,5～7層類圓形或矩形的細胞組成(圖1,D)。中柱原位于根的中央,細胞體積小,等徑或呈圓形、類圓形,細胞質濃厚且細胞核大而明顯(圖1,D)。

2.2 根初生生長與初生結構

銀州柴胡根的初生結構是通過初生生長過程中初生分生組織的衍生細胞進一步分化成熟而來。在此過程中,原表皮組織形成根的表皮,皮層原或基本分生組織形成根的皮層,中柱原形成根的維管柱。表皮、皮層和維管柱組成銀州柴胡根的初生結構。

在初生結構分化過程中,皮層出現相對較早,其次為表皮層和中柱的出現。早期形成的表皮細胞,等徑或類圓形,排列緊密,隨著表皮細胞的成熟,其細胞呈長方柱形。相對于表皮和中柱,皮層細胞體積大,細胞質薄,液泡化明顯,排列相對疏松,緊貼表皮的皮層細胞和內皮層細胞體積較小(圖1,E)。在維管柱最外方,由1圈中柱鞘細胞組成。在維管柱中,韌皮部首先分化,表現為對稱分布的2個區域,該區域細胞體積小且排列緊密,細胞質濃厚且細胞核明顯,在相對位置韌皮部外方分化出最早的原生韌皮部篩管,在熒光顯微鏡下表現為2個細胞壁較厚的菱形細胞(圖1,F),隨之形成后生韌皮部。

在2個韌皮部之間的位置形成木質部,位于外方原生木質部的導管最先形成,內方的后生木質部導管依次形成,木質部脊為2束(圖1,G、H)。本研究采用熒光顯微鏡對銀州柴胡根的初生結構進行了觀察,可明顯觀察到內皮層細胞徑向壁加厚的凱氏帶結構(圖1,H);同時,銀州柴胡根初生結構的表皮細胞上也可觀察到加厚的徑向壁熒光(圖1,H)。

2.3 根次生生長與次生結構

在銀州柴胡根的初生結構中,維管柱主要由初生木質部、初生韌皮部以及外圍的中柱鞘細胞層組成,原形成層位于初生木質部和初生韌皮部之間。隨著發育的進行,位于銀州柴胡根初生木質部和初生韌皮部之間的原形成層恢復分裂能力形成維管形成層(圖2,A)。維管形成層不斷的向內形成次生木質部,向外形成次生韌皮部,隨之原生木質部上方對應的中柱鞘細胞進行分裂并向兩邊擴展,形成連續的維管形成層。

A. 早期維管形成層;B. 維管形成層環;C. 皮層、內皮層、木栓層、栓內層的分泌道以及維管形成層;D. 熒光顯微鏡下表皮細胞的徑向壁加厚、皮層、內皮層、木栓層以及栓內層的分泌道。

在早期,維管形成層產生次生木質部的速度大于形成次生韌皮部,使得維管形成層環不斷的向外推進,最后在次生木質部和次生韌皮部之間形成1個閉合的維管形成層環(圖2,B)。

次生維管組織的產生使得根初生結構如表皮、皮層以及中柱鞘組織不斷地向外推進(圖2,C)。當維管形成層活動到一定的時期,此時根內皮層內方的中柱鞘組織恢復分裂能力形成木栓形成層,木栓形成層向外形成木栓層,向內形成栓內層(圖2,C、D)。

此時,木栓層外方的表皮、皮層等尚未脫落,可明顯的觀察到根表皮細胞徑向壁加厚的熒光以及內皮層的凱氏帶加厚(圖2,D)。隨著栓內層層數的增加,在栓內層中3～4個細胞之間發生細胞壁分離,最初形成3～4個分泌細胞圍繞的細胞腔隙或分泌腔隙(圖2,C、D),隨著發育的進行,分泌細胞的數量不斷增加。

多年生銀州柴胡根周皮由8～15層扁平的細胞組成,最外方的木栓層細胞細胞壁厚,原生質消失;木栓形成層細胞體積較小,細胞質濃厚;內方的栓內層細胞體積較大(圖3,A-C)。隨著維管形成層和木栓形成層的不斷活動,根的直徑不斷增大,表皮和皮層完全脫落(圖3,A、B)。在橫切面上,成熟的根由外到內由周皮(木栓層、木栓形成層和栓內層)、次生韌皮部、維管形成層、次生木質部以及初生木質部組成(圖3,A)。在發育早期,根次生韌皮部較寬廣,占根橫切面面積約70%。隨著根的發育,使得根不斷的增粗生長,次生韌皮部和次生木質部面積不斷增加。多年生銀州柴胡根的次生木質部相對面積不斷增加,且在次生木質部導管周圍分布有細胞壁加厚的木質部纖維群(圖3,B,D)。

在銀州柴胡根次生韌皮部,還觀察到由4～20個分泌細胞圍繞的細胞腔隙(圖3,E)。研究發現,在距離維管形成層5～8個細胞位置的次生韌皮部,形成由4個分泌細胞相互分離而形產生的小細胞腔隙;其中次生韌皮部外圍的細胞腔隙直徑較大,但在木質部中未觀察到由分泌細胞組成的細胞腔隙。隨著根直徑的增加,次生韌皮部和中柱鞘的分泌腔隙數量和分泌細胞的數量逐漸增加。在多年生根的中柱鞘位置,可觀察到由3～16個分泌細胞組成的分泌腔隙(圖3,F～G),在根橫切面上排列為一圈。

在縱切面上,中柱鞘(圖3,H)和次生韌皮部(圖3,I)位置上的分泌腔隙呈引長的管狀結構,特別是中柱鞘位置的分泌腔隙表現為分支的管狀結構(圖3,H)。

3 討 論

中藥柴胡為中國大宗中藥材,關于柴胡屬藥用植物根的結構發育備受關注。本研究結果表明,多年生銀州柴胡根的結構主要由周皮、次生韌皮部和次生木質部組成,這與北柴胡和狹葉柴胡根的一般特點[13-14]一致。在銀州柴胡發育早期的根中尚未觀察到木纖維,但在多年生根次生木質部發現有大量的木纖維群分布,這與北柴胡根的特點[14]類似,但多年生狹葉柴胡根次生木質部纖維少或無[15],明顯區別于銀州柴胡。譚玲玲等[13]和鄭麗等[14]對北柴胡和狹葉柴胡根的發育進行了研究,表明北柴胡初生木質部為二元型,但狹葉柴胡根初生木質部為二元型,少數為三原型。本研究結果顯示,銀州柴胡根初生木質部為二元型,亦有三元型,和狹葉柴胡[14]相吻合,也和李廣民和錢麗霞的報道[16]一致。

此外,本研究采用熒光顯微鏡技術對銀州柴胡根初生結構進行觀察研究,結果顯示在橫切面上,當根初生結構完全分化,除了在根的內皮層細胞可觀察到徑向壁加厚的凱氏帶外,在根表皮細胞的徑向壁亦觀察到加厚的細胞壁結構。雖然本研究尚未證實表皮細胞橫向壁是否具有加厚的細胞壁結構,但從其結構特點來看,推測為一種類似凱氏帶的結構。研究表明,在很多高等植物根內皮層以外的部位均發現凱氏帶或類似凱氏帶的結構,如罌粟科植物白屈菜根的外皮層、天竺葵莖中木栓細胞中以及豌豆黃化苗莖中以及松科植物針葉內皮層細胞壁[17]。在我國,銀州柴胡主要分布在陜西北部、甘肅的榆中和靜寧、寧夏的海源及內蒙古等西北干旱的區域,生長于干燥山坡及多沙地帶瘠薄的土壤中[1]。銀州柴胡根表皮細胞徑向壁加厚,其作用可能類似植物根內皮層凱氏帶,并作為根吸收過程的第一道選擇屏障,起著防止水分通過非共質體外滲、抵御干旱及養分選擇性吸收等重要的角色[17],其具體結構特點還需要從超微結構水平去進一步深入研究。

蔡少青等[18]報道,在北柴胡和狹葉柴胡根的皮層和韌皮部中分布有油室。潘勝利等[19]報道,在柴胡屬植物中柱鞘組織分布有分泌道,而在韌皮部則分布為油室。在植物學上,分泌道是一類引長的管狀結構,而油室則為一種儲存油類物質的細胞腔隙或分泌腔[20]。本研究對銀州柴胡根進行了縱切,結果顯示根中柱鞘和次生韌皮部的分泌腔隙或細胞腔隙均為引長的分泌道,且銀州柴胡根中柱鞘分泌道為一種分支的管狀結構。從分泌道形成的方式來看,銀州柴胡中柱鞘分泌道和次生韌皮部分泌道均為分泌細胞的相互分離而形成,是一種裂生型分泌道,和北柴胡分泌道形成方式[13,20]一致。

Metcalfe和Chalk[21]指出,分泌道在傘形科普遍存在,是傘形科植物的典型結構特點。李廣民和錢麗霞[16]對西北產6種藥用柴胡營養器官的比較解剖學進行了研究,表明分泌道分布于根的皮層和韌皮部中。本研究結果顯示,在根初生結構的皮層中尚未觀察到分泌道的分布,分泌道形成于木栓形成層和維管形成層的活動而產生的栓內層和次生韌皮部而非皮層中,是典型的次生分泌結構,這和北柴胡分泌道的研究結果[13,20]相吻合。由于銀州柴胡根分泌道的形成與中柱鞘和維管形成層衍生細胞的活動密切相關,故稱之為中柱鞘分泌道和次生韌皮部分泌道。從發育的角度,當銀州柴胡根的周皮形成初期,在栓內層中即形成了中柱鞘分泌道,此時次生韌皮部分泌道尚未觀察到,即相對于次生韌皮部分泌道的形成,中柱鞘分泌道出現較早。

銀州柴胡根周皮的栓內層和次生韌皮部均分布有分泌道,與北柴胡和紅柴胡[13-14]一致,但在紫花大葉柴胡根次生韌皮部尚未觀察到分泌道[22]。從分泌道和分泌細胞的數量上來看,相同大小銀州柴胡根中次生韌皮部的分泌道和分泌細胞數量均大于北柴胡而小于狹葉柴胡[15]。由此可見,銀州柴胡根中柱鞘及次生韌皮部分泌道與柴胡屬其他植物相應位置的分泌道在形態上相似,但分泌道的數量及大小等可作為柴胡屬植物重要的分類鑒定依據。