沙地云杉 LBD 基因家族鑒定及鹽脅迫響應分析

王亞萍, 隋明明,白玉娥

(內蒙古農業大學 林學院,呼和浩特 010019)

沙地云杉(Piceamongolica)為松科(Pinaceae)云杉屬(Picea)常綠喬木,是中國珍稀瀕危樹種,也是北方地區防風固沙的優良樹種,其自然分布在內蒙古渾善達克沙地,具有耐旱、耐寒、耐沙埋的優良抗性。因此吸引很多學者研究其分布、栽培、育苗和生理生化、體細胞胚胎發生等[1],但其分子生物學相關研究極少,特別是抗性基因挖掘研究有限,限制了其分子育種及抗性改良研究進程。

轉錄因子(TFs)通過調控基因表達來參與植物許多重要的植物發育過程,如細胞形態發生、信號轉導和環境脅迫反應[2]。其中,LBD基因家族是高等植物一大類轉錄因子之一,具有高度保守的側器官邊界(LOB)結構域。LOB結構域長度約為100個氨基酸,包含3個特定的保守結構域,從N端到C端,分別是C結構域(C-block)、Gly-Ala-Ser區域(GAS-block)和類亮氨酸拉鏈(LX6LX3LX6L)。C結構域是DNA結合所需的,由高度保守的CX2CX6CX3C半胱氨酸基序組成;類亮氨酸拉鏈(LX6LX3LX6L)主要負責蛋白質二聚化過程;GAS基序由49個氨基酸殘基組成,影響蛋白生物功能[3-4]。根據LOB結構域不同,LBD蛋白可分為ClassⅠ類和ClassⅡ類。Ⅰ類LBD蛋白都含有C結構域,GAS區域與亮氨酸拉鏈結構;而Ⅱ類蛋白只包含1個不完整的亮氨酸拉鏈結構,不能形成螺旋結構[5-7],然而,進一步將Ⅰ類細分為Ⅰa～Ⅰe 5個亞類,Ⅱ類分為Ⅱa和Ⅱb 2個亞類[8-9]。首個被發現的LBD基因是擬南芥中的AtLOB,該基因的表達存在組織特異性,只在側生器官的近軸端及側根基部表達[5-6]。近年來,隨著植物基因組和轉錄組數據的不斷公布,分別在擬南芥[10]、煙草[11]、玉米[12]、水稻[6]、楊樹[13]、葡萄[14]、番茄[15]及大豆[16]中鑒定到43,98,44,35,57,30,46,46個LBD基因。目前的研究表明,LBD基因家族在植物葉、根和花發育、組織再生及脅迫響應過程起重要調控作用。如擬南芥LOB及LBD6參與調控葉片發育[3],LBD16和LBD29參與調控擬南芥側根起始[17],LBD15通過調控WUS基因參與頂端分生組織分化[18],LBD16、LBD17、LBD18及LBD19促進愈傷組織形成[19];水稻IG1基因調控水稻穎殼、花及雌配子體發育[20];大豆LBD12響應非生物脅迫(干旱、鹽、冷)和IAA、ABA及SA激素處理進程[16];番茄LBD40介導茉莉酸途徑負調控其抗旱性[21];香蕉LBD5參與茉莉酸信號轉導提高其耐寒性[22];擬南芥LBD37、LBD38和LBD39通過抑制花青素的生物合成來響應氮脅迫[23]。盡管LBD基因家族目前已在多個物種中被鑒定和研究,但在沙地云杉中的鑒定和研究還鮮見報道。

本研究以白音敖包自然保護區生長的沙地云杉為材料,通過參考挪威云杉基因組及前期沙地云杉轉錄組相關數據,篩選并鑒定出30條沙地云杉LBD基因序列,利用生物信息學軟件分析所有LBD的理化性質;并運用多重序列比對對其進行結構和保守性研究;構建沙地云杉、擬南芥及楊樹LBD蛋白系統進化樹,分析其進化關系;利用qRT-PCR檢測LBD在沙地云杉不同組織及鹽脅迫下的表達水平,以期為進一步探究沙地云杉LBD基因家族非生物脅迫功能及分子育種奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理

采取內蒙古赤峰市白音敖包自然保護區沙地云杉同一母樹的成熟種子,將其播種于內蒙古農業大學試驗田,培養條件為25 ℃,16 h光照/8 h黑暗條件,生長1年的幼苗分成葉片、莖、莖尖、主根、側根(3次生物學重復),所有樣品經液氮速凍置于-80 ℃冰箱保存。將生長1年的沙地云杉幼苗進行200 mmol/L鹽脅迫處理,分別在處理0,6,12,24 h后采取整株樣本,液氮速凍后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 沙地云杉LBD基因篩選及理化性質分析

為識別沙地云杉中的LBD蛋白,將從模式物種擬南芥基因組數據庫(https://www.arabidopsis.org/)獲得43個LBD基因的氨基酸序列作為探針,利用BioEdit 7.2.0軟件[24]通過BLASTP比對和HMM比對2種方法對前期沙地云杉葉片轉錄組數據進行了局部BlastP搜索,使用默認參數和E值小于0.001,初步鑒定LBD轉錄因子候選基因,然后用SMART在線軟件對候選LBD蛋白序列進行保守結構域分析,保留具有完整LBD保守結構域的序列,從挪威云杉基因組(https://plantgenie.org/)中進行比較,最終獲得沙地云杉云杉LBD基因成員,并根據它們的基因編號進行命名。使用在線軟件ProtParam(http://web. Expasy.org/protparam/)對沙地云杉LBD基因編碼蛋白的理化性質進行分析。利用ExPASy(http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)計算LBD蛋白氨基酸殘基數、等電點(pI)、分子量(MV),利用CELLO v.2.5在線軟件預測LBD蛋白的亞細胞定位。

1.3 沙地云杉 LBD 系統進化樹構建

從Phytozome13數據庫(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)獲取57個楊樹LBDs的蛋白序列,利用MEGA11軟件對43個擬南芥LBDs、57個楊樹LBDs及30個沙地云杉LBDs蛋白進行多重序列比對,再將多序列比對結果利用 MEGA11軟件采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建LBD系統進化樹,校驗參數設置成1 000次。系統進化樹使用Evolgenius在線軟件(http://www.evolgenius.info/evolview)及Adobe Illustrator 2022進行美化。

1.4 沙地云杉LBD保守結構域分析

采用DNAMAN軟件沙地云杉30個LBDs序列進行保守域分析。為分析沙地云杉LBDs蛋白的保守Motif,通過MEME(http://meme-suite.org/)在線軟件對沙地云杉LBD進行保守Motif分析,將Motif數目設置為10,其他參數都被設置為默認值。

1.5 沙地云杉LBD的表達水平分析

使用TAKARA植物總RNA提取試劑盒分別從沙地云杉不同組織及鹽脅迫處理樣本提取總RNA,通過1.0%瓊脂凝膠電泳及Nanodrop2000測定其RNA完整性和濃度。逆轉錄的cDNA產物在-20 ℃中保存,將cDNA稀釋5倍后作為模板使用。使用Primer3設計qRT-PCR引物(表1)。采用羅氏實時熒光定量PCR儀進行擴增,以EF1α(MA_505653g0010)作為內參基因,采用2-ΔΔCT法計算各基因的相對表達量,并使用SPSS軟件進行顯著性差異分析。用TBtools和GraphPadPrism8軟件分別制作熱圖和柱狀圖。每個處理3個生物重復,每個樣本3個技術重復。

表1 PmLBD 基因家族表達分析的實時熒光定量引物

2 結果與分析

2.1 LBD 基因鑒定與蛋白質理化性質分析

在沙地云杉中共鑒定到30個LBD基因,并根據基因在挪威云杉數據庫的編號進行命名為PmLBD1～PmLBD30。沙地云杉LBD基因的CDS長度從360(PmLBD3)～930 bp(PmLBD3);蛋白序列長度為119(PmLBD3)～309 aa(PmLBD15);分子量為10 545.15(PmLBD22)～33 359.17 D(PmLBD15);等電點為5.15(PmLBD7,PmLBD12)～9.26(PmLBD9);亞細胞定位結果顯示,30個沙地云杉LBD蛋白都位于細胞核內,見表2。

表2 沙地云杉 LBD 基因家族基本信息

2.2 沙地云杉LBD蛋白的保守結構域分析

對30個PmLBD蛋白進行了多序列比對,所有PmLBD家族成員在N端都有1個高度保守的LOB區域,由約100個氨基酸組成(圖1)。多序列比較表明,30個PmLBD均具有1個保守的c基序(CX2CX6CX3C)、GAS-block和亮氨酸拉鏈結構(LX6LX3LX6L)。說明PmLBD家族序列保守性較高,在沙地云杉內可能行使相似的生物學功能。為了進一步研究30個PmLBD結構的多樣性,筆者利用MEME在線工具預測PmLBD蛋白的保守基序組成(圖2)。結果表明,PmLBDs的序列特征識別出了10個基序,所有LBDs都包含motif1、motif2和motif3,構成了LOB結構域中高度保守的部分。除了PmLBD3/7/18外,其余27個PmLBD都具有motif4。基序在大多數序列中的相對位置相似,但不同PmLBD也有一定差異性。其中,motif5分布于PmLBD16/17/26/29中;motif6分布于PmLBD1/25中;motif7分布于PmLBD15/27中;motif8分布于PmLBD10/15/28中;motif9分布于PmLBD4/21中;motif10分布于PmLBD1/2/5中。

圖1 PmLBD蛋白保守結構域序列比對

不同顏色的方塊代表不同的基序(1-10)。

10個motif的氨基酸序列如圖3,motif1為GAS保守結構域,motif2 為CX2CX6CX3C基序,motif3為LX6LX3LX6L。以上結果說明PmLBD具有多種生物學功能。

2.3 沙地云杉LBDs蛋白系統進化分析

為了深入了解沙地云杉PmLBD家族蛋白之間的進化關系,通過MEGA11將沙地云杉(30個)、楊樹(57個)及擬南芥(43個)的130個氨基酸序列構建了系統發育樹(圖4)。根據模式植物擬南芥和楊樹蛋白家族分類,將130個LBDs蛋白分為Class Ⅰ和Class Ⅱ,共7個保守的進化枝。其中,Ⅰ類有111個成員:楊樹(41%)、擬南芥(32%)和沙地云杉(27%),分別為46,36,30個。Ⅱ類有19個成員:楊樹(63%)和擬南芥(37%),分別為11,7個。進一步將Ⅰ類可以細分為5個子類:Class Ⅰa(14%),Class Ⅰb(27%),Class Ⅰc(23%),Class Ⅰd(24%),Class Ⅰe(12%);ClassⅡ可以細分為Ⅱa(58%)和Ⅱb(42%)。

紅色圓圈、綠色三角形和紅色五角星分別代表沙地云杉、楊樹及擬南芥。

其中,LBDs數量最多的是Class Ⅰb,分別包含12個PtLBDs,7個AtLBDs和11個PmLBDs;Class Ⅱb所含LBDs最少,僅有 3 個 AtLBDs 和5個PtLBDs;沙地云杉LBDs在Class Ⅰb中最多,有7個蛋白,但Class Ⅱ中無沙地云杉LBDs 蛋白,這可能與PmLBDs在3個物種中數量最少有關。

系統發育關系結果表明,沙地云杉的LBD蛋白與楊樹的同源性高于擬南芥。

2.4 沙地云杉PmLBDs的組織特異性表達分析

為了進一步了解LBD基因在沙地云杉生長發育中的潛在功能,對LBDs在沙地云杉不同組織(莖尖、主根、側根、莖和葉)中的表達水平進行分析。如熱圖(圖5)所示,30個PmLBDs均被檢測到,大部分LBDs在根和葉中具有較高的轉錄水平,而在莖尖中表達水平較低,表明它們在根和葉的發育中具有重要功能。此外,4個基因(PmLBD2/5/18/19)在莖中高表達,Class I b中的PmLBD9/20/23基因在側根中強烈表達。以上結果表明,不同PmLBD在楊樹各組織器官中功能具有差異。

2.5 沙地云杉PmLBDs在鹽脅迫下的表達模式分析

為探究沙地云杉在鹽脅迫條件下潛在的生物學功能,利用RT-PCR技術對沙地云杉30個LBD基因在鹽脅迫處理下的表達情況進行了分析。結果(圖6)表明在鹽脅迫處理后,除了PmLBD3及PmLBD27基因外,28個沙地云杉LBD基因表達量均發生顯著的變化,且同源性越近的PmLBD表達情況越相似。

* P <0.05, ** P <0.01。

其中,17個PmLBD基因在鹽處理后上調表達,不同的PmLBD基因在不同鹽處理時間達到峰值,包括PmLBD8/18/19/29/30在6 h達到峰值及PmLBD2/16/22在12 h達到峰值,其余PmLBD基因在24 h達到峰值,特別是PmLBD10、PmLBD23及PmLBD28在鹽處理24 h時上調10倍以上;而6個PmLBD基因在鹽處理后下調表達,尤其是PmLBD9在12 h時下調表達10倍多。以上結果說明沙地云杉PmLBD基因家族成員在耐鹽進程中可能發揮不同作用。

3 討 論

LBD基因是1個植物特異性轉錄因子家族,已被證明在植物葉、根和花發育、組織再生及脅迫響應過程起重要調控作用;然而,目前尚未對沙地云杉進行LBD基因的系統研究。2013年,“云杉基因組項目”聯合課題組在Nature上發表挪威云杉基因組草圖,基因組大小為20 Gb,共注釋約28 354個基因[25]。本研究通過參考挪威云杉基因組及前期沙地云杉轉錄組數據,篩選并鑒定了30條沙地云杉LBD基因序列(表2)。沙地云杉的基因組龐大,是擬南芥的100多倍,但在家族成員數量上,PmLBDs小于AtLBDs,這表明沙地云杉在進化過程中丟失了一小部分的LBD基因。多序列比較表明,30個PmLBD均具有1個保守的c基序(CX2CX6CX3C)、GAS-block和亮氨酸拉鏈結構(LX6LX3LX6L)(圖1)。基因結構分析表明,不同LBD成員既有相似性也存在一定結構差異(圖2)。這種差異可能是因為不同亞類的成員在進化過程中經歷了基因片段的剪接或插入[26-27]。LBD亞類中相似的保守序列和基因結構通常意味著這些基因具有相似的生物學功能,這表明LBD家族的基序在整個進化過程中都很保守。

本研究構建了擬南芥、楊樹和沙地云杉的LBD蛋白系統發育樹,130個LBDs蛋白共分為Class Ⅰ和Class Ⅱ(圖4)。以往的研究表明,擬南芥中86%的AtLBD基因、大豆中82%的GmLBD基因和玉米中84%的ZmLBD基因屬于Ⅰ類[5,12,16]。同樣,在本研究中,沙地云杉30個LBD均屬于Ⅰ類。此外,Ⅰ類基因進一步被分為5個亞類。從分布看,Class Ⅰ a、Class Ⅰ b、Class Ⅰ c、Class Ⅰ d和 Class Ⅰ e中每個植物都存在LBD基因,且Class I b中的所有LBD基因共享1支較長的分支,說明這些LBD基因已發生了較大的變異,可能已經分化出新的功能。此外,同源PmLBD基因對在相同組織或相同脅迫下的表達豐度相似(圖5和圖6),表明沙地云杉中的PmLBD基因的重復可能導致了功能的冗余。

多項研究表明LBD蛋白參與調節植物分枝發育和花、莖、葉和根的形成[28-33]。基因的組織特異性表達可以為深入了解其在生長發育中的功能提供見解[34]。在本研究中,分析了PmLBDs在沙地云杉不同組織(莖尖、主根、側根、莖和葉)中的表達水平模式,許多PmLBDs在特定組織中表現出較高的表達水平(圖5)。例如,屬于Class I b分支的PmLBD9、PmLBD20和PmLBD23在側根中高表達,其在擬南芥中同源基因是AT2G30340(AtLBD13),研究表明AtLBD13、AtLBD16、AtLBD18和AtLBD29在調節擬南芥側根發育中發揮重要作用[35-37],故推測其功能可能與AtLBD13相似,可作為調控沙地云杉側根發育的候選基因。另外,筆者發現有4個基因(PmLBD2、PmLBD5、PmLBD18和PmLBD19)在沙地云杉莖組織中強烈表達,表明其在沙地云杉莖發育中起著重要作用。基于這些結果,推測沙地云杉PmLBD基因在其生長發育進程中起著關鍵作用,但具體的生物學功能其調控分子機制需要進一步驗證。

據報道,MYB、WRKY、NAC等轉錄因子參與了抵抗非生物脅迫,幫助植物抵抗或適應環境的變化[38-40]。到目前為止,已有多項研究表明LBD基因在非生物脅迫反應中也發揮著重要作用[41-43]。在本研究中,qRT-PCR結果表明大部分沙地云杉LBD基因響應鹽脅迫,其中57%的基因隨處理時間表達上調,20%的基因表達下調(圖6)。這些結果表明,PmLBD基因廣泛參與沙地云杉的各種非生物脅迫反應。此外,眾所周知,根系是響應干旱和鹽脅迫的主要器官[44]。在本研究中,PmLBD10、PmLBD23及PmLBD28在根中強烈表達且在鹽處理24 h時上調10倍以上,表明這些基因是調控沙地云杉鹽脅迫的候選基因。以往的研究也表明,LBD基因在不同的非生物脅迫下顯著上調表達。例如,馬鈴薯StLBD2-6和StLBD3-5是在干旱脅迫下顯著上調[9];小麥Ta-6B-LBD81、Ta-4B-LBD51和Ta-U-LBD90在鹽脅迫下表達上調,Ta-4A-LBD40和Ta-4D-LBD62在冷脅迫下表達上調,而Ta-2A-LBD13、Ta-2B-LBD15和Ta-2D-LBD18在干旱脅迫下表達上調[43]。值得注意的是在沙地云杉側根中高表達的PmLBD9在12 h時下調表達10倍多,推測其可能是沙地云杉鹽脅迫的負調控基因。在大豆中的研究也發現36個PvLBDs在鹽及重金屬脅迫處理中下調表達[45]。綜上所述,PmLBD基因對鹽脅迫表現出不同程度的反應,雖然其參與非生物脅迫反應的分子機制尚不清楚,但為開展沙地云杉進一步的抗性研究提供了候選基因。

4 結 論

沙地云杉 PmLBD蛋白家族包含30個成員,理化性質分析顯示:蛋白序列長度在119～309 aa之間,分子量為10.5～33.4 kD,等電點為5.15～9.26,Cell-PLoc亞細胞定位顯示均位于細胞核中。按照蛋白結構和聚類分析可以分為5個亞家族,Class I b與Class I e亞家族包含大部分成員。RT-PCR結果表明,沙地云杉PmLBD9、PmLBD20和PmLBD23也可能在側根發生過程中發揮作用。另外發現大部分沙地云杉PmLBD基因響應鹽脅迫,特別是PmLBD10、PmLBD23及PmLBD28在鹽處理24 h時上調10倍以上,可作為調控沙地云杉鹽脅迫的候選基因,但PmLBD9在鹽脅迫中起相反作用。本研究初步揭示了大部分PmLBDs在植物生長發育及鹽脅迫中發揮的作用,為沙地云杉PmLBDs基因功能進一步研究奠定了基礎。