子宮內膜癌病人血清circWHSC1和circPUM1的表達及診斷價值

陰莉，許劍利，程其軍，陳新

作者單位：自貢市第一人民醫院，a婦產科，b中西醫結合肺病科，四川 自貢643000

子宮內膜癌是嚴重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一，發病率占據婦女腫瘤的第二位，病死率占據婦女腫瘤的第三位，多發年齡為圍絕經期與絕經后［1-2］。子宮內膜癌相對宮頸癌與卵巢癌病死率低的原因為可早期發現，早期發現盡早治療情況下預后較好，5年生存率高達90%，但若發現較遲，病死率將急劇升高［3］，因此提高子宮內膜癌的早期診斷效能是臨床孜孜不倦追求的目標。環狀RNA（Circular RNA，circRNAs）是一類非編碼RNA，具有難降解、高穩定性的優點，其可海綿化miRNA，調控子宮內膜癌生物學進程［4-6］。circWHSC1與circPUM1均屬于circRNAs，circWHSC1在宮頸癌細胞C-33A中過表達可促進癌進展，反之會抑制癌進展［7］；circ-WHSC1可通過海綿化miR-212-5p調控AKT3表達參與三陰性乳腺癌的腫瘤進展以及糖酵解途徑［8］。circPUM1可通過海綿吸附miR-615-5p與miR-6753-5p促進卵巢癌的發生與發展［9］；circPUM1在結腸癌中可促進惡性生物學行為［10］。但關于circWHSC1和circPUM1在子宮內膜癌中的表達情況以及所發揮的作用仍未見研究。因此，本研究將從此著手，檢測子宮內膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達水平，分析其對子宮內膜癌診斷的價值，為子宮內膜癌早期診斷提供候選分子標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年6月至2020年6月自貢市第一人民醫院接受治療的120例子宮內膜癌病人作為子宮內膜癌組，年齡40～65（52.35±7.24）歲；其中絕經者81例，未絕經者39例。根據FIGO分期標準分為：Ⅰ期66例，Ⅱ期26例，Ⅲ期18例，Ⅳ期10例。根據組織學分化程度高低分為高分化（G1）組71例、中分化（G2）組35例、低分化（G3）組14例。

納入標準：①病人均接受手術治療；②病理資料完整；③納入研究前未接受放化療以及分子靶向治療；④病人知情同意。

排除標準：①存在其他腫瘤占位；②入院存在感染；③精神認知障礙；④肝腎功能衰竭。

另選取自貢市第一人民醫院同期行診斷性刮宮確認為子宮內膜增生的病人123例作為子宮內膜增生組，年齡40～65（54.21±7.17）歲。選取體檢健康者125例作為對照組，年齡40～65（53.37±7.58）歲。子宮內膜癌組、子宮內膜增生組、對照組年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 血清標本采集 子宮內膜癌組病人術前、子宮內膜增生組病人確診后、對照組體檢時抽取空腹靜脈血5 mL，4 ℃條件下離心，離心力設置為800g，得上清液保存至-20 ℃冰箱內待測。

1.3 研究對象血清circWHSC1和circPUM1水平測定 Trizol法提取子宮內膜癌組、子宮內膜增生組和對照組血清總RNA，使用反轉錄試劑盒將5 μg RNA反轉錄為cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTM進行擴增，內參選用GAPDH，circWHSC1、circPUM1、GAPDH引物序列由上海生工生物工程有限公司構建，序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

反轉錄試劑盒（D7178M）購自上海碧云天；SYBR Premix Ex TaqTM（DRR420A）購自北京智杰方遠科技有限公司。qRT-PCR反應條件為95 ℃預變性10 min；40個PCR循環（95 ℃變性10 s；55 ℃退火20 s；72 ℃延伸15 s）。2-ΔΔCt方法計算子宮內膜癌病人血清中circWHSC1、circPUM1相對表達量。

1.4 統計學方法 數據分析采用SPSS 25.0軟件。本研究計數資料均符合正態分布，以描述，多組間比較采用單因素方差分析，有差異后兩兩比較再采用SNK-q檢驗；以例（%）描述計數資料，采用χ2檢驗；logistic回歸分析法分析血清circWHSC1和circPUM1水平與子宮內膜癌發病的關系；ROC曲線分析血清circWHSC1和circPUM1表達水平對子宮內膜癌的診斷價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組研究對象血清circWHSC1和circPUM1表達水平比較 與對照組相比，子宮內膜增生組血清circWHSC1、circPUM1表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），子宮內膜癌組血清circWHSC1、circPUM1表達水平均升高（P＜0.05）；與子宮內膜增生組相比，子宮內膜癌組血清circWHSC1、circPUM1表達水平均升高（P＜0.05），見表2。

表2 三組血清中circWHSC1和circPUM1表達水平比較/

表2 三組血清中circWHSC1和circPUM1表達水平比較/

注：①與對照組相比，P＜0.05。②與子宮內膜增生組相比，P＜0.05。

circPUM1 1.01±0.18 1.02±0.17 1.76±0.25①②546.93＜0.001組別對照組子宮內膜增生組子宮內膜癌組F值P值例數125 123 120 circWHSC1 1.02±0.21 1.04±0.19 1.93±0.24①②715.08＜0.001

2.2 子宮內膜癌不同組織學分化程度病人血清circWHSC1、circPUM1表達水平比較 與G1組相比，G2組、G3組子宮內膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達水平均升高（P＜0.05）；與G2組相比，G3組子宮內膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達水平均升高（P＜0.05），見表3。

表3 不同組織學分化程度子宮內膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達水平比較/

表3 不同組織學分化程度子宮內膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達水平比較/

注：①與G1組相比，P＜0.05。②與G2組相比，P＜0.05。

組別G1組G2組G3組F值P值circPUM1 1.28±0.19 2.35±0.28①2.78±0.52①②396.29＜0.001例數71 35 14 circWHSC1 1.36±0.22 2.43±0.24①3.89±0.32①②748.45＜0.001

2.3 子宮內膜癌不同FIGO分期病人血清circWHSC1、circPUM1表達水平比較 與Ⅰ期病人相比，Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期子宮內膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達水平升高（P＜0.05）；與Ⅱ期病人相比，Ⅲ期、Ⅳ期子宮內膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達水平均升高（P＜0.05）；與Ⅲ期病人相比，Ⅳ期子宮內膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達水平均升高（P＜0.05），見表4。

表4 不同FIGO分期子宮內膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達水平比較/

表4 不同FIGO分期子宮內膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達水平比較/

注：①與Ⅰ期相比，P＜0.05。②與Ⅱ期相比，P＜0.05。③與Ⅲ期相比，P＜0.05。

circPUM1 1.34±0.19 1.82±0.22①2.46±0.31①②2.94±0.58①②③181.87＜0.001組別Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期Ⅳ期F值P值例數66 26 18 10 circWHSC1 1.28±0.18 1.79±0.20①3.36±0.44①②3.76±0.34①②③512.81＜0.001

2.4 logistic回歸分析法分析血清circWHSC1、circPUM1表達水平與子宮內膜癌的關系 以血清circWHSC1、circPUM1表達水平為自變量，以是否發生子宮內膜癌為因變量，circWHSC1、circPUM1表達水平與子宮內膜癌的發病密切相關（OR=2.75、3.71，P＜0.05），見表5。

表5 血清circWHSC1、circPUM1表達水平與子宮內膜癌的關系

2.5 ROC曲線分析血清circWHSC1、circPUM1表達水平對子宮內膜癌的診斷價值 血清circWHSC1表達水平對子宮內膜癌診斷的曲線下面積為0.88，最佳截斷值為3.01，此時的靈敏度為88.2%，特異度為81.5%；血清circPUM1表達水平對子宮內膜癌診斷的曲線下面積為0.82，最佳截斷值為1.65，此時的靈敏度為79.8%，特異度為83.1%；二者聯合檢測對子宮內膜癌診斷的曲線下面積為0.95，靈敏度為89.1%，特異度為93.5%。

3 討論

子宮內膜癌是女性常見生殖道惡性腫瘤，其發病率隨社會發展而升高，圍絕經期以及絕經后婦女卵巢功能衰竭，雌激素降低，免疫功能減弱，較容易發病。早期發現及早治療是子宮內膜癌預后良好的前提條件，治病于初有助于病人長期生存。因此診斷標志物的探尋是臨床的長久課題，對于提升子宮內膜癌的生存率具有重要意義。

circRNAs是非編碼RNA中的一種，是目前RNA領域的新研究熱點，其呈閉環狀，含有大量miRNA的結合位點，可作為miRNA海綿吸附miRNA，進而調控miRNA下游靶基因，發揮對靶基因的調控作用，在多種惡性腫瘤中發揮關鍵作用。比如谷文露等［11］通過高通量測序技術篩選得到hsa_circ_0008234在肺腺癌組織中低表達，并通過臨床肺腺癌組織、癌旁組織標本以及細胞實驗驗證，沉默hsa_circ_0008234表達可促進肺腺癌細胞增殖與遷移；鄒晨等［12］研究發現circ_0076704在人胃癌組織中高表達。而circWHSC1來源于WHSC1基因的外顯子反向剪接。Zong等［13］研究顯示，circWHSC1可通過吸附miR-145與miR-1182，調節其下游靶點MUC1以及hTERT表達。MUC1、hTERT被證實在子宮內膜樣腺癌中高表達［14-15］。推測circWHSC1可能在子宮內膜癌中發揮一定作用。本研究中子宮內膜癌病人血清circWHSC1表達水平顯著高于對照組以及子宮內膜增生組病人血清circWHSC1表達水平，提示circWHSC1可能在子宮內膜癌中發揮促癌作用，logistic回歸分析與ROC曲線結果顯示，circWHSC1與子宮內膜癌的發病密切相關，且當circWHSC1表達水平高于3.013時，對子宮內膜癌的發病有較高診斷價值，此時診斷曲線下面積為0.86，靈敏度、特異度均較高，提示circWHSC1有望作為子宮內膜癌診斷的血清標志物。進一步研究顯示，血清circWHSC1與子宮內膜癌病人臨床FIGO分期、組織學分化程度等臨床病理特征相關，提示circWHSC1與子宮內膜癌的發展有一定關系。

circPUM1是一種功能性circRNA，定位于線粒體，其在肺腺癌中高表達，在體內與體外增強細胞腫瘤的發生［16］；circPUM1可通過對miR-615-5p與miR-6753-5p的調控參與卵巢癌的發生與發展［9］；circPUM1在食管癌中有致癌特性，可能通過抑制食管癌細胞的細胞焦亡促進腫瘤生長［17］。但其在子宮內膜癌中仍未見研究，基于子宮內膜癌是一個受多基因調控的惡性腫瘤，且circPUM1擁有多個miRNA結合位點，我們猜測circPUM1可能在子宮內膜癌中發揮作用。本研究中子宮內膜癌病人血清circPUM1水平顯著高于對照組以及子宮內膜增生組，提示子宮內膜癌中血清circPUM1表達異常，可能與癌進展有關，logistic回歸分析顯示，circPUM1表達水平與子宮內膜癌的發病密切相關，提示血清circPUM1可能作為診斷子宮內膜癌發病的一個血清標志物，本研究進一步使用ROC曲線分析，結果顯示血清circPUM1表達水平診斷子宮內膜癌發生的曲線下面積為0.80，診斷效能高，當血清circPUM1表達水平高于1.650時，病人罹患子宮內膜癌的可能性較高，此時診斷靈敏度、特異度分別為78.3%、84.8%，診斷可靠性較高，病人需做進一步檢查確診。本研究進一步對子宮內膜癌病人臨床病理特征進行分析，發現血清circPUM1表達水平與組織學分化程度、臨床FIGO分期有一定相關性，提示其可能參與子宮內膜癌的癌進展，可作為一個長期監控指標。通過將血清circWHSC1與circPUM1聯合檢測，發現可提高對子宮內膜癌的診斷效能，診斷靈敏度與特異度均升高。

綜上所述，子宮內膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達水平處于高位，二者聯合檢測有望作為篩查子宮內膜癌病人的血清標志物，為子宮內膜癌的早期診斷做貢獻。但本研究存在樣本量不足、研究不深入等局限，下一步將擴大樣本量進行驗證，并進行細胞以及體內實驗進行進一步探討。