微RNA-582-5p與音猬因子在結直腸癌病理診斷和預后評估中的價值

孫志濤，姜輝，張寶玉，高晶晶，肖偉，周國慶，宋東旭，張亞玲，馬紅艷

作者單位：滄州市人民醫院，a胃腸外科，b肛腸外科，c神經外科，d病理科，河北 滄州061000

結直腸癌是常見消化道惡性腫瘤，發病率與病死率在我國呈上升趨勢，由于其具有侵襲性，易發生轉移，多數病人確診時已到局部晚期或遠處轉移，治療效果不理想，病人預后較差，晚期病人的5年生存率較低，因此，對結直腸癌的早期診斷及預后評估具有重要意義［1-2］。音猬因子（sonic hedgehog，SHH）是信號通路蛋白，是干細胞自我更新的重要調控蛋白，與腫瘤的發生與惡性進展有關，研究表明，結直腸癌組織中SHH表達明顯上調，抑制SHH通路激活可抑制結直腸癌的遷移與侵襲［3-4］。經Targetscan在線預測發現，微RNA-582-5p（miR-582-5p）與SHH存在靶向結合位點，而目前研究發現miR-582-5p在多數腫瘤中呈低表達，如在膀胱癌中，過表達miR-582-5p可抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡［5］。另有研究顯示，環狀RNA泛素相關蛋白2（circUBAP2）通過調節miR-582-5p/叉頭盒蛋白O1（FOXO1）增強自噬并促進結直腸癌進展和轉移［6］，故推測miR-582-5p也參與結直腸癌的發生發展。miR-582-5p是否與SHH共同參與結直腸癌的發生發展尚未見報道，本研究檢測結直腸癌組織中miR-582-5p與SHH的表達情況，分析miR-582-5p與SHH水平在結直腸癌病人病理診斷和預后評估中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年6月至2018年12月在滄州市人民醫院收治的125例結直腸癌病人作為觀察對象，所選病人均取結直腸癌組織及癌旁組織，125例病人中，腫瘤長徑＜5 cm 69例，≥5 cm 56例；腫瘤部位為結腸77例，直腸48例；腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期65例，Ⅲ～Ⅳ期60例；有脈管侵犯51例，無脈管侵犯74例；有淋巴結轉移60例，無淋巴結轉移65例。另選同期經病理診斷為結直腸息肉的97例病人作為結直腸息肉組。

納入標準：（1）經病理學檢查確診為結直腸癌；（2）術前未經過抗腫瘤治療；（3）病人臨床資料與隨訪資料完整；（4）病人或其近親屬知情同意。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤或轉移性結直腸癌病人；（2）合并高血壓、糖尿病、感染性疾病病人；（3）合并肝腎功能不全者。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。獲得所有組織標本一部分-80 ℃冰箱保存，一部分使用4%甲醛溶液固定使用石蠟包埋。

1.2 研究方法

1.2.1 qRT-PCR檢測miR-582-5p及SHH mRNA的表達 各組織標本-80 ℃冰箱保存，各標本取50 mg，研磨后加入Trizol試劑（上海，Beyotime）提取總RNA，PrimeScript? RT Master Mix（日本，Takara）合成cDNA后，采用SYBR Green Master（德國，Roche）進行PCR擴增，各引物引物序列（廣州，Ribobio）見表1。反應結束后，分別以U6、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參基因，采用2-ΔΔCt分析法計算miR-582-5p、SHH mRNA相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2 免疫組織化學染色 各標本經石蠟包埋，連續切片后，使用兔抗人SHH單克隆抗體（上海，Beyotime）（1∶1 000稀釋），SupervisionTM二步法免疫組化染色，陰性對照以PBS作為一抗，陽性對照為已知SHH陽性組織切片，由兩位資深病理醫師雙盲診斷。

染色結果判斷：SHH陽性表現為黃色顆粒，主要分布于細胞質，陽性細胞數分別為0～10%、＞10%～25%、＞25%～50%、＞50%～75%、＞75%，計為0、1、2、3、4分；細胞染色強度無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計0、1、2、3分。兩項積分相乘≤1分為陰性（-），≥2分為陽性（+）。

1.2.3 miR-582-5p與SHH的靶向驗證 結腸癌細胞系HCT116（上海中國科學院細胞庫）以每孔5×104個細胞接種在24孔板中，待細胞貼壁生長至約60%時，將構建的pmirGLO雙螢光素酶野生型（wt）與突變型（mut）SHH表達載體（Promega公司）分別與miR-582-5p mimics、miR-NC質粒（廣州，Ribobio）共轉染細胞24 h，每組設置6個復孔，檢測各組細胞螢光素酶活性。

1.3 統計學方法 利用SPSS 22.0進行統計學分析，miR-582-5p、SHH mRNA表達水平用表示，兩組比較行t檢驗，多組比較行單因素方差分析；計數資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；Pearson分析結直腸癌組織中miR-582-5p與SHH mRNA表達的相關性，Kaplan-Meier曲線分析miR-582-5p、SHH表達與病人預后相關性；受試者操作特征（ROC）曲線分析miR-582-5p、SHH mRNA對結直腸癌的診斷價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-582-5p及SHH mRNA表達水平比較qRT-PCR結果顯示，在癌旁組織、結直腸息肉組織、結直腸癌組織中miR-582-5p表達水平依次降低（F=521.23，P＜0.001），SHH mRNA表達水平依次升高（F=661.24，P＜0.001），見表2。

表2 miR-582-5p及SHH mRNA表達水平比較/

表2 miR-582-5p及SHH mRNA表達水平比較/

注：miR-582-5p為微RNA-582-5p，SHH為音猬因子。①與癌旁組織比較，P＜0.05。②與結直腸息肉組織比較，P＜0.05。

組別癌旁組織結直腸息肉組織結直腸癌組織F值P值SHH mRNA 1.03±0.12 1.78±0.34①2.47±0.41①②661.24＜0.001例數125 97 125 miR-582-5p 1.05±0.15 0.83±0.12①0.65±0.09①②521.23＜0.001

2.2 SHH蛋白表達水平比較 免疫組織化學染色結果顯示，SHH蛋白在結直腸癌組織、結直腸息肉組織、癌旁組織中陽性表達率分別為67.20%（84/125）、34.48%（30/87）、19.20%（24/129），三組之間比較差異有統計學意義（χ2=61.58，P＜0.001），結直腸癌組織、結直腸息肉組織SHH蛋白陽性表達率高于癌旁組織（χ2=6.31，P=0.012；χ2=58.68，P＜0.001），結直腸癌組織SHH蛋白陽性表達率顯著高于結直腸息肉組織（χ2=22.09，P＜0.001），見圖1，表3。

圖1 結直腸癌癌旁組織、結直腸息肉組織、結直腸癌組織SHH蛋白表達（SP×200）:A為癌旁組織SHH陰性表達;B為結直腸息肉組織陽性表達;C為結直腸癌組織SHH陽性表達

表3 音猬因子（SHH）蛋白在三種標本的表達/

表3 音猬因子（SHH）蛋白在三種標本的表達/

注：①與癌旁組織比較，P＜0.05。②與結直腸息肉組織比較，P＜0.05。

陰性/例101 67 41組別癌旁組織結直腸息肉組織結直腸癌組織例數125 97 125陽性/例24 30 84陽性率/%19.20 30.93①67.20①②

2.3 結直腸癌組織中miR-582-5p與SHH mRNA的相關性 Pearson相關性分析顯示，結直腸癌組織中miR-582-5p與SHH mRNA表達呈負相關性（r=-0.63，P＜0.05），如圖2。

圖2 結直腸癌組織中miR-582-5p與SHH mRNA相關性

2.4 miR-582-5p與SHH的靶向驗證 如圖3所示，經Targetscan在線預測發現，miR-582-5p與SHH存在靶向結合位點。雙螢光素酶實驗檢測結果顯示，野生型（wt）SHH表達載體與miR-582-5p mimics共轉染HCT116后，與miR-NC比較，相對螢光素活性顯著降低（P＜0.05），見表4。

圖3 微RNA-582-5p（miR-582-5p）與音猬因子（SHH）的靶向結合位點預測

表4 雙螢光素酶活性檢測結果/

表4 雙螢光素酶活性檢測結果/

注：miR-582-5p為微RNA-582-5p，SHH為音猬因子。

組別miR-NC miR-582-5p mimics t值P值SHH-mut 0.98±0.09 1.03±0.10 0.91 0.384 SHH-wt 1.01±0.13 0.37±0.05 11.26＜0.001

2.5 miR-582-5p、SHH與結直腸癌臨床病理特征的關系 miR-582-5p在腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、有脈管侵犯和有淋巴轉移的結直腸癌組織中表達水平低于腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期、無脈管侵犯和無淋巴轉移的結直腸癌組織（P＜0.05），SHH在腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、有脈管侵犯和有淋巴轉移的結直腸癌組織中陽性表達率高于腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期、無脈管侵犯和無淋巴轉移的結直腸癌組織（P＜0.05），見表5。

2.6 miR-582-5p、SHH mRNA對結直腸癌的診斷價值分析 以是否為結直腸癌作為因變量，以結直腸息肉、結直腸癌中miR-582-5p、SHH mRNA表達為自變量，經ROC曲線分析顯示，miR-582-5p診斷結直腸癌的AUC為0.82，95%CI：（0.76，0.87），P＜0.05，截斷值為0.71，靈敏度為76.00%，特異度為77.32%，SHH mRNA診斷結直腸癌的AUC為0.86，95%CI：（0.81，0.90），P＜0.05，截斷值為2.11，靈敏度為80.00%，特異度為79.38%，二者聯合診斷結直腸癌的AUC為0.92，95%CI：（0.88，0.95），P＜0.05，靈敏度為86.40%，特異度為85.57%，聯合診斷效能高于單獨檢測（Z=3.00，P=0.002；Z=2.31，P=0.021）。

2.7 miR-582-5p、SHH與結直腸癌病人預后關系根據ROC曲線診斷的截斷值，將miR-582-5p表達分為高表達組（≥0.71）與低表達組（＜0.71），Kaplan-Meier曲線分析顯示，miR-582-5p低表達和SHH陽性表達病人無進展生存期和總生存期顯著低于miR-582-5p高表達（χ2=4.70，P=0.030；χ2=5.43，P=0.020）和SHH陰性表達（χ2=12.72，P＜0.001；χ2=6.51，P=0.010），見圖4。

圖4 miR-582-5p、SHH與結直腸癌病人預后關系

3 討論

miRNA可參與調控腫瘤細胞增殖、血管生成、腫瘤耐藥性等過程，在腫瘤中異常表達，成為腫瘤診斷和預后預測的生物標志物［7］。miR-582-5p與腫瘤的發生密切相關，多項研究［8-10］顯示，miR-582-5p在胃癌、肺癌、骨肉瘤等多種腫瘤中明顯低表達，過表達miR-582-5p可顯著抑制腫瘤細胞增殖與侵襲，發揮抑癌作用。Huang、Dai等［11］研究表明，長鏈非編碼RNA DCST1-AS1通過靶向miR-582-5p表達調控HMGB1蛋白表達，促進結直腸癌細胞的生長與侵襲。本研究結果顯示，miR-582-5p在結直腸癌組織中表達水平顯著降低，與Huang、Dai等［11］研究結果一致，且miR-582-5p表達顯著低于結直腸息肉組織中表達水平，提示miR-582-5p可能與結直腸癌的發生有關，其機制可能與miR-582-5p參與調控腫瘤細胞的增殖有關。研究［12］顯示，在非小細胞肺癌中，miR-582-5p的表達在TNM分期較高、伴淋巴結轉移病人癌組織中表達水平較低，提示miR-582-5p表達與腫瘤進展有關。本研究結果顯示，miR-582-5p在腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、有脈管侵犯和有淋巴轉移的結直腸癌組織中表達水平顯著低于腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期、無脈管侵犯和無淋巴轉移結直腸癌組織中的表達水平，提示miR-582-5p的低表達與結直腸癌的進展和發生轉移有關。研究［10］顯示，在骨肉瘤中，與miR-582-5p低表達，過表達miR-582-5通過靶向抑制神經腫瘤腹側抗原1表達，抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移與侵襲能力。在前列腺癌中過表達miR-582-5p通過抑制TGF-β信號通路抑制前列腺癌骨轉移［13］。這些研究表明，miR-582-5p通過調控不同的靶基因或通路影響腫瘤的侵襲與轉移，推測其在結直腸癌中的轉移與侵襲中發揮重要的調控作用。

SHH信號通路是參與干細胞自我更新調控的重要通路，在調節干細胞增殖、分化、胚胎發育過程中起著重要的作用，此外，SHH信號通路也調控著腫瘤干細胞的自我更新，在維持腫瘤干細胞樣特性、腫瘤惡性進展發揮關鍵作用［14］。多項報道［15-16］顯示，多種腫瘤如肝癌、膀胱癌、胰腺癌、結直腸癌等與SHH信號通路異常激活有關。本研究結果顯示，結直腸癌組織中SHH mRNA表達水平及蛋白陽性表達率顯著升高，且在腫瘤分期較高、有脈管侵犯和有淋巴轉移的結直腸癌組織中蛋白陽性表達率更高，與報道一致，研究［17］顯示，SHH在結直腸癌中表達上調，且SHH的上調表達在維持結腸癌細胞干性時發揮重要作用。表明在結直腸癌中，存在SHH信號通路激活，而抑制SHH信號通路激活可顯著抑制腫瘤細胞增殖、遷移與侵襲［18］。提示SHH通路在結直腸癌中可能發揮促進腫瘤細胞增殖與遷移，進而促進結直腸癌發生發展的作用。

本研究還發現，結直腸癌組織中miR-582-5p表達水平與SHH mRNA表達呈負相關性，且通過生物信息學軟件targetscan預測發現，miR-582-5p與SHH存在靶向結合位點，雙螢光素酶報告基因實驗結果證實miR-582-5p和SHH存在靶向關系，

推測miR-582-5p可能通過靶向調控SHH表達調控結直腸癌細胞增殖、遷移與侵襲，促進結直腸癌的發生發展。另外，本研究還顯示，miR-582-5p、SHH對結直腸息肉、結直腸癌的鑒別診斷有一定臨床意義，二者聯合診斷結直腸癌的靈敏度與特異度更高，提示miR-582-5p、SHH可能成為結直腸癌病理診斷的標志物。

基因異常表達與腫瘤預后密切相關，研究［19］顯示miR-582-5p、SHH表達還與癌癥病人預后相關，miR-582-5p的低表達與SHH高表達與病人不良預后有關。本研究顯示，miR-582-5p低表達和SHH陽性表達病人的無進展生存期和總生存期顯著低于miR-582-5p高表達和SHH陰性表達病人，提示miR-582-5p、SHH與病人預后有關，提示miR-582-5p、SHH可能作為評估結直腸癌預后的標志物，推測其原因為miR-582-5p低表達和SHH陽性表達結直腸癌惡性進展更快，可能發生轉移進而影響預后。

綜上所述，結直腸癌組織中miR-582-5p低表達、SHH高表達，且與結直腸癌病人臨床病理特征和預后有關，可能成為結直腸癌的病理診斷和預后評估的標志物，對臨床診斷具有一定價值意義，其具體作用機制需更深入地研究。