趨化素樣因子超家族6和程序性死亡受體-配體1在腦膠質(zhì)瘤中的表達及其與預(yù)后的關(guān)系

鄭永，劉杰

作者單位：解放軍總醫(yī)院三中心神經(jīng)創(chuàng)傷外科，北京100039

腦膠質(zhì)瘤是最為常見的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是由多環(huán)節(jié)多因素共同作用的最終結(jié)果。同時，筆者考慮其分子特點非常復(fù)雜，故對其從信號傳導(dǎo)通路和基因水平等領(lǐng)域進行多層次的深入研究。結(jié)合相關(guān)文獻顯示，從分子水平闡明惡性腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的病理機制對完善癌癥病人診治方案，改善預(yù)后狀況具有重要的價值［1］。趨化素樣因子超家族6（chemokine-like factor-like MARVEL transmembrane domain-containing family member 6，CMTM6）是由3號染色體的基因簇編碼而成的，其屬于特殊結(jié)構(gòu)域蛋白（MARVEL），經(jīng)證實其在分泌蛋白和穿膜蛋白的轉(zhuǎn)運期間發(fā)揮重要的作用，且在腫瘤、胚胎發(fā)育和表觀遺傳等方面發(fā)揮重要的作用［2］。在肺腺癌和口腔鱗癌等惡性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，CMTM6通過介導(dǎo)程序性死亡受體-配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）的表達來對惡性腫瘤病人發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用［3］。PD-L1是多種免疫細(xì)胞表達的表面膜蛋白，直接參與惡性腫瘤的分子調(diào)控。目前，已經(jīng)有關(guān)于PD-L1在胃癌、口腔鱗癌和肺腺癌等多種惡性腫瘤中表達的研究，并就此研制的新型免疫抑制劑也廣泛應(yīng)用于臨床，但對于PD-L1在腦膠質(zhì)瘤中的研究較為罕見［4］。為了明確CMTM6、PD-L1與腦膠質(zhì)瘤病人預(yù)后狀況的關(guān)系，評定其在腦膠質(zhì)瘤診治中的價值，本研究采用免疫組化Envision二步法檢測腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及正常腦組織標(biāo)本中CMTM6、PD-L1的表達水平，分析兩者與預(yù)后狀況的關(guān)系，以期為腦膠質(zhì)瘤病人的診治及預(yù)后評價提供指導(dǎo)價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年1月至2017年1月解放軍總醫(yī)院三中心神經(jīng)外科住院部收治的腦膠質(zhì)瘤病人95例作為觀察組。男51例，女44例，年齡＜40歲41例，年齡≥40歲54例，病灶長徑＜3 cm 43例，≥3 cm 52例，病理學(xué)分級：低病理級別53例作為低病理級別組（Ⅰ級11例，Ⅱ級42例），高病理級別42例作為高病理級別組（Ⅲ級29例，Ⅳ級13例）。疾病類型：間變性星形細(xì)胞瘤27例，少突-星形細(xì)胞瘤26例，彌漫性星形細(xì)胞瘤14例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤17例，毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤9例，室管膜下巨細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤2例。臨床癥狀：眩暈55例，癲癇57例，卡氏功能狀態(tài)評分（Karnofsky performance scores，KPS）≥70分64例，＜70 分31例。同時，選擇顱腦外傷去骨瓣減壓術(shù)病人89例作為對照組，要求兩組在手術(shù)中采集腦組織標(biāo)本。全部病人手術(shù)前均被告知手術(shù)內(nèi)容及其注意事項，并簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 觀察組經(jīng)影像學(xué)和病理組織學(xué)檢查明確腦膠質(zhì)瘤的診斷，對照組僅符合顱腦外傷的診斷，初次發(fā)病，首次實施手術(shù)治療。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 手術(shù)前接受化療、放療等，入組前合并腦卒中、腦疝、其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病、精神心理異常，術(shù)后隨訪資料不完整，隨訪期間死亡［5］。

1.3 檢測方法 采用免疫組化Envision二步法檢測腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織的CMTM6、PD-L1蛋白表達。

1.3.1 試劑與儀器 兔多克隆CMTM6抗體（美國Abcam公司），兔單克隆PD-L1抗體（Cell Signaling公司），磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液、辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗原修復(fù)液等均購自武漢賽維爾生物有限公司。

1.3.2 操作方法 采集的腦組織標(biāo)本即刻采用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)組織切片，滴入兔多克隆CMTM6抗體（1∶100稀釋）或兔單克隆PDL1抗體（1∶200稀釋），經(jīng)4 ℃過夜，PBS沖洗后滴入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗，室溫條件下孵育15 min，將石蠟組織芯片90 ℃烤片3 h，將組織芯片進行脫蠟水化處理后于PBS浸洗5 min×3次，電飯鍋隔水加熱至100 ℃，使用EDTA進行抗原修復(fù)30 min，芯片緩緩降溫后于3%雙氧水浸泡30 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶，經(jīng)DAB顯色液顯色沖洗、蘇木精復(fù)染、冷水缸返藍(lán)、1%鹽酸-乙醇分化、脫水風(fēng)干后采用中性樹膠封片等處理后選擇染色均勻及清晰的組織芯片進行顯微鏡觀察。選取每張免疫反應(yīng)較強的區(qū)域，400倍高倍鏡視野下不重復(fù)觀察5個視野，計算CMTM6陽性細(xì)胞數(shù)量。免疫組織化學(xué)計分標(biāo)準(zhǔn)［6］：①陽性細(xì)胞百分率≤25%則計1分，＞25%～50%則計2分，＞50%～75%則計3分，＞75%則計4分。②染色程度：無染色則計0分，淡黃色則計1分，黃色或棕褐色則計2分，褐色則計3分，以兩者評分之和作為最終評分，以0分作為陰性，1～3分則作為弱陽性，4～7分則作為強陽性。由兩位高級病理科醫(yī)師在雙盲條件下按照陽性細(xì)胞百分比和染色程度進行閱片評分，各切片觀察5個視野（×400），取平均值，對于閱片結(jié)果不一致的切片則要求另一名病理科醫(yī)師進行閱片，最終閱片結(jié)果由3名醫(yī)師共同鑒定。根據(jù)CMTM6表達陽性與否將膠質(zhì)瘤病人分為CMTM6陽性表達組和CMTM6陰性表達組，PD-L1表達陽性與否將膠質(zhì)瘤病人分為PD-L1陽性表達組和PD-L1陰性表達組。

1.4 觀察指標(biāo) 比較觀察組和對照組CMTM6、PDL1蛋白表達的差異，進一步比較不同病理學(xué)分級CMTM6、PD-L1蛋白表達的差異，明確CMTM6、PDL1蛋白表達在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。采用電話、門診結(jié)合微信隨訪獲取術(shù)后5年生存相關(guān)數(shù)據(jù)，比較CMTM6陽性表達組和CMTM6陰性表達組累積總生存率和無病生存率，比較PD-L1陽性表達組和PD-L1陰性表達組累積總生存率和無病生存率，分析CMTM6、PD-L1表達水平是否與預(yù)后狀況有關(guān)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包和MedCalc軟件包進行數(shù)據(jù)錄入及統(tǒng)計學(xué)處理。應(yīng)用Kolmogorov-Smirnov檢驗計量資料是否符合正態(tài)分布，對于符合正態(tài)分布的計量資料以表示，兩組比較采用成組設(shè)計資料的t檢驗，計數(shù)資料以例（%）表示，兩組比較采用配對χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CMTM6、PD-L1蛋白表達的比較 免疫組化染色結(jié)果顯示，95例腦膠質(zhì)瘤組織（觀察組）和89例正常腦組織（對照組）CMTM6蛋白主要在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達，可見棕褐色顆粒狀物質(zhì)。PDL1蛋白主要分布于細(xì)胞膜內(nèi)，呈棕褐色顆粒狀物質(zhì)，少量可見于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。觀察組CMTM6陽性表達率為85.11%（78/95），明顯高于對照組的26.97%（24/89），PD-L1陽性表達率為54.74%（52/95），明顯高于對照組的13.48%（12/89），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=56.55，34.47，P＜0.05），見表1。

表1 腦膠質(zhì)瘤95例和腦外傷89例CMTM6、PD-L1蛋白表達的比較/例（%）

高病理級別膠質(zhì)瘤組織CMTM6陽性表達率為95.24%（40/42），明顯高于低病理級別的71.70%（38/53），PD-L1陽性表達率為73.81%（31/42），明顯高于低病理級別的39.62%（21/53），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.84，11.05，P＜0.05），見表2。

2.2 生存分析 95例腦膠質(zhì)瘤病人中，78例CMTM6陽性病人作為CMTM6陽性表達組，17例CMTM6陰性病人作為CMTM6陰性表達組。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，CMTM6陽性表達組的累積總生存率較CMTM6陰性表達組的降低幅度更明顯，兩組1、2、3年累積生存率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而4、5年累積生存率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 腦膠質(zhì)瘤CMTM6陽性表達組與CMTM6陰性表達組累積總生存率的比較/例（%）

CMTM6陽性表達組的無病生存率較CMTM6陰性表達組的降低幅度更明顯，CMTM6陽性表達組的1、2、3、4、5年無病生存率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 腦膠質(zhì)瘤CMTM6陽性表達組與CMTM6陰性表達組無病生存率的比較/例（%）

2.3 PD-L1表達與腦膠質(zhì)瘤病人預(yù)后狀況的關(guān)系 在95例腦膠質(zhì)瘤病人中，52例PD-L1陽性病人作為PD-L1陽性表達組，43例PD-L1陰性病人作為PD-L1陰性表達組。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，PD-L1陽性表達組的累積總生存率較PD-L1陰性表達組的降低幅度更明顯，兩組1年累積生存率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而2、3、4、5年累積生存率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

表5 腦膠質(zhì)瘤程序性死亡受體-配體1（PD-L1）陽性表達組與PD-L1陰性表達組5年累積總生存率的比較/例（%）

PD-L1陽性表達組的無病生存率較PD-L1陰性表達組的降低幅度更明顯，PD-L1陽性表達組的1年無病生存率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而2、3、4、5年無病生存率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表6。

表6 腦膠質(zhì)瘤程序性死亡受體-配體1（PD-L1）陽性表達組與PD-L1陰性表達組無病生存率的比較/例（%）

3 討論

腦膠質(zhì)瘤常呈浸潤性生長，增殖侵襲能力較強，且由于化療耐受而限制化療的臨床應(yīng)用，盡管手術(shù)和放射治療技術(shù)的不斷完善，但仍無法降低復(fù)發(fā)風(fēng)險。因此，探尋腦膠質(zhì)瘤的新型治療靶點具有重要的意義。隨著對CMTM家族各成員研究的不斷深入，CMTM6和腦膠質(zhì)瘤、肺癌、腎癌、胃癌和肝癌等多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展具有緊密的關(guān)系。楊小駿等［7］對42例乳腺癌及癌旁組織進行CMTM6表達水平檢查發(fā)現(xiàn)，癌癥組織CMTM6陽性表達率明顯高于癌旁組織，且CMTM6高表達病人生存期明顯縮短，提示CMTM6高表達是惡性腫瘤病人預(yù)后不良的獨立風(fēng)險因子。PD-L1是各種實體瘤病人的主要生物標(biāo)志物，其表現(xiàn)為異常激活或過度表達狀態(tài)，尤其是胃癌、尿路上皮癌、腎細(xì)胞癌、肺癌和黑色素瘤等。張武文、汪付兵［8］研究顯示，PD-L1信號通路與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后狀況具有明顯的關(guān)系。廖婧等［9］研究則顯示，CMTM6可有效維持PD-L1的穩(wěn)定性，預(yù)防PD-L1在肺癌和黑色素瘤的溶酶體水解，為阻斷PD-1/PD-L1信號通路的免疫逃逸提供了理論依據(jù)。Cox回歸模型分析顯示，CMTM6高表達是癌癥病人預(yù)后不良的主要影響因素，其有望成為惡性腫瘤病人的新型治療靶點，并在減少腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、抑制腫瘤生長繁殖和延長生存時間等方面提供新的思路。相關(guān)研究［10］顯示，CMTM6表達與頭暈具有明顯的相關(guān)性。同時，作為常見的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，癲癇是腦膠質(zhì)瘤的主要癥狀，而李明賀等［11］研究則證實，CMTM6、PD-L1與癲癇發(fā)作具有明顯的關(guān)系，上述研究提示了可從CMTM6和PD-L1入手，采用免疫組化法測定CMTM6和PD-L1陽性表達率，明確兩者表達是否與病理特征及預(yù)后狀況有關(guān)，假設(shè)該項結(jié)論成立，則將為腦膠質(zhì)瘤病人治療方案的制定與調(diào)整提供新的思路。筆者考慮CMTM6和PD-L1在免疫逃逸中發(fā)揮的協(xié)同效應(yīng)，故本研究就CMTM6和PD-L1在腦膠質(zhì)瘤病人中的表達及其與預(yù)后狀況進行研究，以明確兩者表達水平在改善預(yù)后狀況中的作用。

本研究結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤組織CMTM6、PDL1陽性表達率明顯高于正常腦組織，而高病理級別膠質(zhì)瘤組織的陽性表達率則明顯高于低病理級別，提示CMTM6、PD-L1在腦膠質(zhì)瘤組織中呈高表達，且與病理學(xué)分級具有明顯的關(guān)系。梁博等［12］研究則證實，CMTM6與癲癇發(fā)作程度具有明顯的關(guān)系，該項研究提示，癲癇主要累及低病理級別膠質(zhì)瘤病人，但結(jié)合本研究結(jié)果低病理級別膠質(zhì)瘤組織的CMTM6陽性表達率則相對降低，上述結(jié)論是否存在矛盾則需擴大樣本量以驗證兩者的可靠性。進一步就累積生存率和無病生存率的Kaplan-Meier生存分析顯示，CMTM6陽性表達的腦膠質(zhì)瘤病人4、5年累積總生存率較陰性表達的病人明顯降低，PD-L1陽性表達病人的2、3、4、5年累積總生存率和無病生存率也較PD-L1陰性表達組明顯降低，提示腦膠質(zhì)瘤組織CMTM6、PD-L1與腦膠質(zhì)瘤病人預(yù)后狀況具有緊密的關(guān)系，主要表現(xiàn)為兩者的高表達往往提示預(yù)后狀況不良［13-15］。究其原因為：CMTM6、PD-L1通過影響抗腫瘤免疫反應(yīng)而導(dǎo)致術(shù)后生存率降低［16-17］。但結(jié)合本研究結(jié)果提示，CMTM6陽性和陰性表達的腦膠質(zhì)瘤病人累積生存率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其可能與研究樣本量較小具有一定的關(guān)系［18-19］。CMTM6和PD-L1均定位于循環(huán)核內(nèi)體和質(zhì)膜內(nèi)，前者通過介導(dǎo)PD-L1的表達以促進兩者之間的結(jié)合，最終拮抗T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)［20-25］。本研究采用定位準(zhǔn)確、敏感性和特異性較高的免疫組化染色技術(shù)，以期提高檢測結(jié)果的可靠性。因此，筆者確信CMTM6、PD-L1與腦膠質(zhì)瘤病人預(yù)后狀況具有明顯的關(guān)系。

綜上所述，CMTM6、PD-L1與腦膠質(zhì)瘤病人病理學(xué)分級具有緊密的關(guān)系，且兩者陽性表達往往提示預(yù)后狀況不良，往后將以CMTM6為靶點拮抗PDL1信號通路可成為腦膠質(zhì)瘤病人的治療突破點。目前針對CMTM6、PD-L1在腦膠質(zhì)瘤組織中表達的相關(guān)研究較為罕見，往后需大量的人體組織學(xué)樣本進行測定，以進一步闡明兩者在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展期間的分子作用機制。但盡管如此，CMTM6、PD-L1有望為腦膠質(zhì)瘤病人免疫藥物治療靶點及預(yù)后評價提供重要的指導(dǎo)意義。