血清長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因1、微RNA-329-3p表達水平與急性腦梗死發生風險的關系

滕玉環，徐晨輝，陳季南，李軍榮

作者單位：南京市江寧醫院神經內科，江蘇 南京211100

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）是由于各種原因導致大腦動脈狹窄或堵塞引起大腦供血不足的腦血管疾病，是臨床較為常見的神經系統疾病之一，臨床癥狀主要表現為頭暈、語言及肢體功能障礙等，嚴重者可有意識障礙，常突然發病，病情可迅速進展，嚴重威脅病人生命健康。研究表明，ACI的發病機制極為復雜，高齡、動脈硬化、血液高黏滯性等與ACI的發病有著密切的關系［1-3］。因此，研究與ACI有關的標志物及其與疾病發生風險的關系，對ACI的早期防治具有重要意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200個核苷酸的內源性非編碼RNA，可通過調控其他基因的轉錄、翻譯過程在細胞分化、凋亡等多種生理病理過程中發揮重要作用，近年來有研究表明，lncRNA異常表達與腦血管疾病的發生關系密切［4］。長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1）作為一種lncRNA，其表達參與調節血管內皮細胞增殖和血管生成［5］。據報道，lncRNA SNHG1可通過抑制神經炎細胞凋亡延緩ACI進展，在ACI的發生發展過程中發揮重要作用［6］。微RNA（microRNAs，miRNAs）是一類非編碼小分子RNA，研究表明，其在腦血管疾病的發生發展過程中具有重要作用［7］，通過在生物信息學StarBase網站（http：//starbase.sysu.edu.cn/）發現lncRNA SNHG1、miR-329-3p存在結合位點，因此本研究探討了lncRNA SNHG1、miR-329-3p二者與ACI的關系，miR-329-3p作為一種miRNAs，是14q32 miRNA基因簇的成員，研究表明，多種14q32 miRNA分子在血管重塑中發揮重要作用，可延緩心血管疾病的發生發展［8］。目前關于lncRNA SNHG1、miR-329-3p在腦血管疾病中的臨床相關研究甚少，因此本研究通過檢測ACI病人血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p表達水平變化，探討其與疾病發生風險的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年9月至2021年9月在南京市江寧醫院收治的162例ACI病人作為觀察組，其中男90例，女72例，年齡范圍為49～85歲，年齡（66.96±13.98）歲，卒中病因學分型：大動脈粥樣硬化61例、小血管閉塞47例、心源性栓塞35例、其他19例。納入標準：①符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》［9］中關于ACI的診斷標準；②經頭顱MRI檢查確診證實；③住院時間＞7 d；④臨床資料完整；⑤病人或其近親屬知情同意并簽署知情同意書。排除標準：①合并肝硬化、脂肪肝等肝膽系統疾??；②近半年內有創傷史和外科手術史；③患有自身免疫性疾病、腫瘤、精神疾??；④合并冠心病等心血管疾病；⑤近期服用抑制炎癥類藥物、免疫抑制劑等。另選取同時期在本院體檢的165例健康志愿者作為對照組，其中男88例，女77例，年齡范圍為48～86歲，年齡（66.52±14.04）歲。ACI病人嚴重程度根據美國國立衛生研究院卒中量表（NIHSS）［10］分為輕度ACI組60例（NIHSS≤7分）、中度ACI組56例（8分≤NIHSS≤13分）和重度ACI組46例（NIHSS≥14分）。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 收集所有受試者以下臨床資料：性別、年齡、吸煙史、飲酒史、高血壓和糖尿病病史、身體質量指數（body mass index，BMI）、NIHSS評分、收縮壓（systolic pressure，SBP）、舒張壓（diastolic pressure，DBP）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDLC）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）等。

1.2.2 樣品采集 所有ACI病人入院次日清晨及體檢者體檢當時采集空腹靜脈血5 mL，將收集的血液標本以3 000 r/min的轉速離心10 min后取上層血清，置于-80 ℃冰箱中待測。

1.2.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p的相對表達量 取所有血清樣本，加入1 mL Trizol試劑（美國Invitrogen公司）提取總RNA，測定RNA純度和濃度，將其反轉錄為cDNA，采用qRT-PCR對lncRNA SNHG1、miR-329-3p進行擴增，引物序列見表1。lncRNA SNHG1反應條件為：95 ℃，5 min；96 ℃，10 s；60 ℃，35 s；以GAPDH作為內參。miR-329-3p反應條件為：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；75 ℃，50 s；以U6作為內參，采用2-ΔΔCt法分析lncRNA SNHG1、miR-329-3p的表達水平。lncRNA SNHG1、GAPDH、miR-329-3p、U6引物序列由上?；蚧瘜W有限公司構建；qRT-PCR儀（型號Applied Biosystems 9700）購自美國Life Technologies公司。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.3 統計學方法 用SPSS 25.0軟件進行數據統計學分析，計量資料（呈正態分布，且方差齊）以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，三組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間的比較采用SNK-q檢驗；等級資料（NIHSS評分）比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Spearman法分析lncRNA SNHG1、miR-329-3p與NIHSS評分的關系；采用Pearson法分析lncRNA SNHG1與miR-329-3p水平的關系；使用ROC曲線分析lncRNA SNHG1、miR-329-3p對ACI的診斷價值；多因素logistic回歸分析ACI發生的影響因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般臨床資料比較 兩組病人性別、年齡、吸煙史、飲酒史、BMI、SBP、DBP、HDL-C、LDL-C等比較均差異無統計學意義（P＞0.05），觀察組高血壓史比例、糖尿病病史比例、NIHSS評分、TC、TG顯著高于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 急性腦梗死及健康志愿者一般臨床資料比較

2.2 兩組血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平比較 與對照組比較，觀察組病人lncRNA SNHG1水平明顯降低，miR-329-3p水平明顯升高（P＜0.05），見表3。

表3 兩組血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平比較/

表3 兩組血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平比較/

注：lncRNA SNHG1為長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因1，miR-329-3p為微RNA-329-3p。

miR-329-3p/U6 1.01±0.03 2.15±0.70 20.90＜0.001組別對照組觀察組t值P值例數165 162 lncRNA SNHG1/GAPDH 1.03±0.04 0.34±0.08 98.91＜0.001

2.3 不同嚴重程度病人血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平比較 與輕度ACI組比較，中度ACI組病人lncRNA SNHG1水平明顯降低，miR-329-3p水平明顯升高（P＜0.05），與中度ACI組比較，重度ACI組病人lncRNA SNHG1水平明顯降低，miR-329-3p水平明顯升高（P＜0.05），見表4。

表4 不同嚴重程度急性腦梗死病人血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平比較/

表4 不同嚴重程度急性腦梗死病人血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平比較/

注：lncRNA SNHG1為長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因1，miR-329-3p為微RNA-329-3p。①與輕度ACI組比較，P＜0.05。②與中度ACI組比較，P＜0.05。

miR-329-3p/U6 1.51±0.50 2.20±0.69①2.92±0.97①②49.63＜0.001組別輕度ACI組中度ACI組重度ACI組F值P值例數60 56 46 lncRNA SNHG1/GAPDH 0.43±0.09 0.35±0.08①0.21±0.07①②96.04＜0.001

2.4 ACI病人血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p與NIHSS評分的相關性以及lncRNA SNHG1、miR-329-3p之間的相關性分析 相關性分析結果顯示，血清lncRNA SNHG1與NIHSS評分呈負相關（r=-0.30，P＜0.001），miR-329-3p與NIHSS評分呈正相關（r=0.63，P＜0.001）；通過生物信息學StarBase網站（http：//starbase.sysu.edu.cn/）發現lncRNA SNHG1、miR-329-3p存在結合位點，ACI病人血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p表達呈負相關（r=-0.61，P＜0.001）。

2.5 lncRNA SNHG1、miR-329-3p對ACI的診斷價值 ROC曲線結果顯示，血清lncRNA SNHG1診斷ACI發生的ROC曲線下面積（AUC）為0.78（0.73，0.83），靈敏度為78.2%，特異度為82.7%，截斷值為0.74，血清miR-329-3p診斷ACI發生的AUC為0.72（0.66，0.76），靈敏度為73.3%，特異度為67.9%，截斷值為1.34，二者聯合診斷ACI發生的AUC為0.83（0.78，0.87），靈敏度為73.3%，特異度為86.4%，與lncRNA SNHG1單獨診斷相比，二者聯合診斷ACI發生的AUC差異無統計學意義（Z=1.33，P=0.920），與miR-329-3p單獨診斷相比，二者聯合診斷ACI發生的AUC更高（Z=2.93，P=0.003）。

2.6 多因素logistic回歸分析ACI發生的影響因素 將ACI是否發生作為因變量，以高血壓史、糖尿病病史、TC、TG、lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平作為自變量進行多因素logistic回歸分析，其中TC、TG、lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平均以ACI病人的平均值為界轉換為二分類變量，具體賦值見表5。結果顯示，高血壓史、糖尿病病史、TC高水平、TG高水平、lncRNA SNHG1低水平、miR-329-3p高水平是影響ACI發生的危險因素（P＜0.05），見表6。

表5 變量賦值說明

3 討論

ACI是臨床常見的腦血管疾病，在我國約占急性腦血管病的70%～80%，ACI具有高發病率、高復發率、高致殘率、高死亡率特征，并且發病率和復發率呈逐年上升趨勢，嚴重影響病人的生活質量和生命健康。血清學檢測是一種非侵入性、便捷的早期篩查方法，因此，尋找與ACI有關的血清標志物以及探討其與疾病發生風險的關系，對ACI的早期防治具有重要意義［11-13］。

據報道，SNHG1是一個與癌癥有關的lncRNA，已有大量研究結果表明，lncRNA SNHG1參與心肌細胞肥大［14］、心肌缺血/再灌注損傷［15］等多種心血管疾病的發生發展過程，此外，最近的研究表明，lncRNA SNHG1異常表達還與腦血管疾病的發生有關，例如Zhang等［16］研究結果表明，lncRNA SNHG1可減小大腦中動脈閉塞小鼠模型的腦梗死面積，而抑制lncRNA SNHG1表達則會增大腦梗死面積，且lncRNA SNHG1可作為miR-18a的競爭性內源性RNA發揮作用，從而調節其內源性靶標缺氧誘導因子-1α的去抑制，并通過缺氧誘導因子-1α/血管內皮細胞生長因子信號傳導促進腦微血管內皮細胞（BMEC）存活。Wang等［17］研究結果表明，lncRNA SNHG1的異常表達與缺血性中風后的血管生成有關，lncRNA SNHG1對BMEC存活和血管生成中形態、功能的影響依賴于miR-199a，miR-199a參與調節缺氧誘導因子和血管內皮細胞生長因子的表達。本研究結果表明，與對照組相比，觀察組病人血清lncRNA SNHG1表達水平顯著降低，提示lncRNA SNHG1異常低表達可能與ACI的發生有關。進一步研究表明，血清lncRNA SNHG1水平隨病情嚴重程度增加而降低，且ACI病人血清lncRNA SNHG1水平與NIHSS評分呈負相關，表明lncRNA SNHG1表達水平變化與病人病情嚴重程度有關，檢測其表達可能對評估病人病情嚴重程度有幫助。ROC曲線分析表明，lncRNA SNHG1診斷ACI發生的AUC為0.78，靈敏度為78.2%，特異度為82.7%，提示lncRNA SNHG1對ACI具有良好的診斷價值。此外，多因素logistic回歸分析顯示，lncRNA SNHG1低水平是影響ACI發生的危險因素，提示lncRNA SNHG1可作為ACI風險預測的標志物。

miRNAs是一類長度約為22個核苷酸的非編碼小分子RNA，具有調控多種動植物基因轉錄翻譯的生物學功能，人們發現miRNAs異常表達與心腦血管疾病的發生關系密切［18］，miR-329-3p作為一種miRNAs，miR-329-3p異常表達不僅與多種癌癥的發生密切相關，且在心腦血管疾病的發生中發揮重要作用，Goossens等［19］研究結果表明，抑制miR-329-3p表達，可增加缺血后血管生成，從而減輕血管疾病的發生。Rafiei等［20］研究結果表明，冠心病病人外周血單核細胞miR-329呈高表達，miR-329異常高表達與動脈粥樣硬化斑塊的發生有關。Lin等［21］研究結果表明，在神經元分化過程中，miR-329-3p的表達上調，而轉錄因子E2F1的表達下調，miR-329-3p可通過抑制E2F1在調節神經干細胞增殖中發揮關鍵作用。以上結果表明miR-329表達與血管疾病有關。本研究結果表明，與對照組相比，觀察組病人血清miR-329-3p水平明顯升高，且其水平隨病人病情的加重而升高，與Rafiei等［20］研究類似，提示miR-329-3p異常高表達可能參與ACI的發生，且可作為評估病人病情嚴重程度的指標之一。經Spearman法分析發現，ACI病人血清miR-329-3p水平與NIHSS評分呈正相關，進一步表明miR-329-3p表達水平與病人病情嚴重程度有關。此外，本研究還發現，血清miR-329-3p水平可作為診斷ACI的有效指標，且高血壓史、糖尿病病史、TC高水平、TG高水平、miR-329-3p高水平是影響ACI發生的危險因素，提示miR-329-3p對評估ACI的發生風險有積極作用。臨床上不僅要關注影響ACI發生的常見因素（高血壓、糖尿病及血脂指標），還需密切注意lncRNA SNHG1、miR-329-3p在ACI發病中的作用。

NIHSS評分是評估ACI病人神經功能缺損程度的指標，但NIHSS評分主觀性強，在部分昏迷及反應遲鈍的老年人中應用不理想［22］。因此，本研究擬選用穩定的血清指標（lncRNA SNHG1、miR-329-3p）輔助診斷ACI，結果表明，lncRNA SNHG1、miR-329-3p對診斷ACI均有幫助，二者聯合診斷ACI發生的AUC更高，且可提高對ACI診斷的特異度。He等［23］研究報道，lncRNA SNHG1可能通過調節miR-329-3p的表達在小膠質細胞活化中發揮重要作用。本研究發現，ACI病人血清中lncRNA SNHG1與miR-329-3p的表達水平呈負相關，提示lncRNA SNHG1、miR-329-3p可能共同參與ACI的發生，推測lncRNA SNHG1可能通過靶向調控miR-329-3p的表達參與ACI的發生，但具體調控機制還需后續研究。