高尿酸血癥對雌性大鼠生殖功能的影響

宋淼,鄒通,徐禮斌,龔雪琳,王笑峰,邢士超

(青島大學,山東 青島 266021 1 基礎醫學院病原生物學系; 2 口腔醫學院)

尿酸是嘌呤代謝的終末產物。在我國,高尿酸血癥(HUA)的患病率為13.3%,其中女性的患病率為7.9%[1-2]。近年來,女性不孕率不斷升高,這與飲食、生活習慣和環境等因素密切相關[3]。研究表明,HUA與女性生殖障礙之間存在密切聯系,但其機制尚不清楚[4-5]。在中樞神經系統中,親吻肽(Kiss-peptin)通過調節促性腺激素釋放激素(GnRH)影響下丘腦-垂體-性腺軸[6]。Kisspeptin蛋白由吻素1(KISS1)基因所編碼,通過與吻素1受體(KISS1R)結合,發揮其生物學功能[7]。Kisspeptin和其受體KISS1R基因敲除的小鼠無正常的動情周期,且卵巢更小,存在生育困難[8-9]。本實驗通過構建HUA雌性大鼠模型,觀察雌鼠動情周期、器官濕質量系數、卵巢病理變化及卵巢組織中KISS1和KISS1RmRNA的表達,探究HUA對雌鼠生殖功能的影響。現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

健康成年雌性Wistar大鼠14只,12周齡,體質量為(240±20)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。腺嘌呤(北京索萊寶生物科技有限公司);氧嗪酸鉀(生工生物工程股份有限公司);質量分數為0.10的高酵母飼料(北京博泰宏達生物技術有限公司);毛細玻璃管(華西醫科大學儀器廠);真空采血管(康衛仕醫療器械有限公司);低溫離心機(賽默飛科技有限公司);PCR試劑盒(塞維爾生物科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1動物分組及處理 采用隨機數字法將大鼠分為HUA組和對照組,每組7只。HUA造模參考李傳偉等[10]的方法。HUA組大鼠飲食分為兩個階段:第1階段,飼喂高酵母飼料,并且用40 g/L的腺嘌呤溶液按照100 mg/(kg·d)的劑量灌胃;在檢測到大鼠血尿酸(SUA)水平顯著下降時,進入第2階段,繼續飼喂高酵母飼料,腺嘌呤劑量減半,同時每日12:00給予大鼠腹腔注射氧嗪酸鉀,用量為100 mg/(kg·d)。整個實驗持續9周。對照組大鼠飼喂普通飼料,并且給予等體積的蒸餾水進行灌胃。兩組大鼠均每間隔1周內眥取血0.5 mL,以3 500 r/min 離心10 min,取血清,采用生化分析儀檢測SUA。

1.2.2動情周期觀察 在確認造模成功后(第7周),每天8:00和20:00,抓取大鼠放置于手心,將沾有生理鹽水的細小棉棒緩慢地插入大鼠陰道后稍停留,并輕輕旋轉,緩慢地拔出,將陰道內含物均勻地涂抹在載玻片上,待自然干燥后,用亞甲藍染色5 min,顯微鏡下觀察。參考印丹丹等[11]的方法,根據細胞種類和比例的變化來判斷動情周期,直至觀察一個完整的動情周期。

1.2.3器官濕質量系數測定 在造模第9周后處死大鼠,留取完整的子宮、卵巢,吸干表面水分后稱質量,計算器官系數。子宮(卵巢)系數=子宮(卵巢)質量(mg)/大鼠體質量(g)×100%。

1.2.4卵巢組織病理學觀察 卵巢稱質量后,取部分組織立即置于40 g/L甲醛中進行固定,制備組織蠟塊,切片(5 μm),行蘇木精-伊紅(HE)染色,顯微鏡下觀察。

1.2.5卵巢組織KISS1和KISS1RmRNA表達檢測 剩余部分卵巢組織用trizol提取mRNA,逆轉成為cDNA后,使用PCR試劑盒進行實時熒光定量PCR(qPCR)檢測。所用引物及其序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 PCR引物及其序列(5′→3′)

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 兩組SUA水平比較

在模型構建第1、5、7、9周時,HUA組大鼠的SUA水平均顯著高于對照組(F=9.430～28.910,P<0.05),表明HUA大鼠模型造模成功。見表2。

表2 兩組大鼠SUA水平比較

2.2 兩組動情周期比較

雌性大鼠動情周期可分為4個階段。①動情前期:涂片可見大量有核上皮細胞和少量的角化上皮細胞(圖1A);②動情期:涂片可見滿視野的角化上皮細胞和少量的有核上皮細胞(圖1B);③動情后期:涂片上有核上皮細胞、角化上皮細胞、白細胞均可見且比例相當(圖1C);④動情間期:可見大量的白細胞和黏液(圖1D)。與對照組相比,HUA組大鼠動情前期、動情期、動情后期時間無明顯變化,而動情間期明顯縮短(F=14.000,P<0.01)。見表3。

A:動情前期;B:動情期;C:動情后期;D:動情間期。亞甲藍染色,200倍。

表3 兩組大鼠動情周期比較

2.3 兩組器官濕質量系數比較

與對照組相比,HUA組大鼠的子宮系數無明顯變化,但卵巢系數顯著下降(t=2.377,P<0.05),說明HUA對卵巢產生影響。見表4。

表4 兩組器官濕質量系數比較

2.4 卵巢組織病理學觀察

兩組大鼠卵泡細胞的發育和成熟正常,病理切片無明顯改變,說明HUA對卵巢組織沒有明顯破壞。見圖2。

2.5 兩組卵巢組織KISS1和KISS1R mRNA表達比較

qPCR檢測結果顯示,與對照組相比,HUA組大鼠卵巢組織中KISS1和KISS1RmRNA表達顯著增高(t=3.456、5.408,P<0.05)。見表5。

表5 兩組大鼠卵巢組織KISS1和KISS1R基因表達比較

3 討 論

隨著生活水平的提高,我國HUA發病率越來越高,女性發病率也呈現出逐年增長的趨勢。尿酸不僅已經被證實是心血管疾病和高脂血癥、糖尿病等代謝類疾病的風險因素[12],還與多種女性生殖障礙類疾病相關,如多囊卵巢綜合征、子宮內膜異位、妊娠并發癥等[5,13]。

在雌性哺乳動物中,動情周期分為動情前期、動情期、動情后期和動情間期4個階段。雌性大鼠體內的激素水平、卵巢和子宮的生理狀態都隨著動情周期的改變而變化,動情周期是雌性生殖健康的重要標志[14]。動情周期是由下丘腦-垂體-性腺軸所控制的,主要通過GnRH進行調節,主要有兩種調節模式:一種是脈沖式分泌模式,負責刺激卵泡發育和類固醇生成;另一種則是激增分泌模式,主要負責誘導促黃體生成素的激增[15]。KISS1R是GnRH神經元脈沖式分泌活動調節的關鍵受體[16]。荀文娟等[17]研究發現,KISS1/KISS1R系統對豬的發情周期具有重要的調節作用。本文研究結果顯示,與對照組相比較,HUA組大鼠卵巢組織中KISS1和KISS1RmRNA的表達水平均明顯增高,尤其是KISS1RmRNA的表達增高更為顯著。KISS1RmRNA編碼的產物為Kisspeptin蛋白受體,本研究HUA組大鼠動情間期縮短,可能是由于KISS1R表達水平升高,使大鼠對激素更加敏感所致。

卵巢KISS1/KISS1R系統還控制著卵泡發育、卵母細胞成熟、調節排卵和卵巢類固醇激素的合成等[18]。FABOV等[19]研究發現,在卵巢的體外模型中,低劑量的Kisspeptin蛋白對卵巢有保護、抗凋亡的作用,而高劑量的Kisspeptin蛋白對卵巢具有負向調節作用。本研究HUA組大鼠卵巢組織中KISS1mRNA表達水平增高,但卵巢系數下降。猜測這可能是由于卵巢中Kisspeptin蛋白過量表達,卵巢功能被抑制所導致的。但目前尚缺乏直接證據與大規模的臨床研究證實這一猜測。

綜上所述,HUA可能通過KISS1系統導致雌性大鼠動情周期紊亂和卵巢系數下降,這為HUA的早期篩查及其并發癥的預防性治療提供了新的理論依據,也為女性生殖障礙相關疾病的診療提供了新的思路。