紫癜性腎炎病兒轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶-2的表達(dá)及其意義

趙海燕,高媛,王大海,聶娜娜,林毅,常紅

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部?jī)嚎茖W(xué)系,山東 青島 266071; 2 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院; 3 青島大學(xué)附屬醫(yī)院兒童腎臟風(fēng)濕免疫科)

過(guò)敏性紫癜(HSP),又稱(chēng)為IgA血管炎,是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的系統(tǒng)性血管炎。30%～50%的病兒可以并發(fā)腎臟損害,稱(chēng)為紫癜性腎炎(HSPN),而HSPN是影響HSP遠(yuǎn)期預(yù)后的重要因素[1]。迄今,HSPN的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。當(dāng)前研究認(rèn)為,IgA1糖基化異常和IgA1免疫復(fù)合物形成是引起HSP腎臟損傷的關(guān)鍵[2]。半乳糖缺乏的IgA1(Gd-IgA1)可以與特異性IgG抗體結(jié)合,形成Gd-IgA1-IgG免疫復(fù)合物。增多的IgA1循環(huán)免疫復(fù)合物在髓樣IgA Fc受體(CD89)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(CD71)參與下沉積于系膜區(qū),誘導(dǎo)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶-2(TG2)活化并與之結(jié)合,一方面促進(jìn)IgA1免疫復(fù)合物在系膜區(qū)沉積,另一方面誘導(dǎo)促炎遞質(zhì)釋放,啟動(dòng)炎癥正反饋通路,導(dǎo)致腎小球系膜的免疫損傷,最終引起腎小球硬化[3-4]。TG2是一種Ca2+依賴(lài)的具有轉(zhuǎn)酰胺基作用的酶,在許多生理和病理?xiàng)l件下發(fā)揮重要作用。它在血管內(nèi)皮表面和細(xì)胞外基質(zhì)中表達(dá)豐富,在腎小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞中均有表達(dá)[5-6]。但作為與Gd-IgA1、CD89、CD71分子作用密切相關(guān)的一個(gè)因素,TG2在HSP腎臟損傷中的表達(dá)如何,目前相關(guān)研究較少。本研究通過(guò)檢測(cè)HSP病兒血清及尿液中的TG2水平,對(duì)尿液TG2水平與血清TG2水平、24 h尿蛋白定量進(jìn)行相關(guān)性分析,探討TG2在兒童HSPN中的表達(dá)變化及意義。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象及分組

2019年2—12月,選取青島大學(xué)附屬醫(yī)院心腎免疫兒科住院治療的91例HSP病兒作為研究對(duì)象。根據(jù)病兒是否并發(fā)腎臟損傷,分為HSPN組(39例)和非HSPN組(NHSPN組,52例)。所有病兒均為新診斷病例,既往無(wú)其他原發(fā)、繼發(fā)性腎小球疾病,無(wú)呼吸、循環(huán)、消化、血液系統(tǒng)急慢性疾病,無(wú)家族性尿檢異常,近4周內(nèi)無(wú)糖皮質(zhì)激素及免疫增強(qiáng)劑或免疫抑制劑等特殊藥物使用情況。HSP的診斷依據(jù)2006年歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟兒童風(fēng)濕病協(xié)會(huì)制定的兒童血管炎的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[7]。HSPN的診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)腎臟病學(xué)組制定的《紫癜性腎炎診治循證指南(2016)》[8]。另選取同期于青島大學(xué)附屬醫(yī)院兒童保健科健康體檢的兒童30例作為對(duì)照組。本研究獲青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(QYFYWZLL27161),所有受試兒童家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清和尿液TG2水平

HSP病兒于入院后第2天清晨、健康兒童于體檢當(dāng)日清晨,空腹采集外周靜脈血2 mL并留取尿液2 mL,分別置于普通干試管和尿管中,室溫放置2 h,以3 000 r/min離心20 min,除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清液1 mL,平均分裝于2～3個(gè)EP管中,放于-80 ℃超低溫冰箱中保存。采用人組織TG2檢測(cè)試劑盒(武漢Elabscience生物科技股份有限公司)對(duì)血清、尿液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 HSPN組病兒24 h尿蛋白定量測(cè)定

收集HSPN組病兒入院第2天的全部尿液,攪拌混勻,測(cè)定尿量總量。取10 mL置于尿管中,采用雙縮脲法測(cè)定尿液中的蛋白水平,最后計(jì)算出24 h尿蛋白定量值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組一般資料比較

本文3組兒童性別構(gòu)成及年齡比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組一般資料比較

2.2 各組血清及尿液TG2水平比較

本文3組兒童尿液TG2水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.473,P<0.05),HSPN組病兒的尿液TG2水平明顯低于對(duì)照組及NHSPN組(t=4.906、6.944,P<0.01)。3組兒童血清TG2水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.523,P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組兒童血清及尿液TG2水平的比較

2.3 有和無(wú)蛋白尿HSPN病兒尿液TG2水平比較

根據(jù)有無(wú)蛋白尿?qū)SPN病兒分為有蛋白尿組(28例)和無(wú)蛋白尿組(11例)。有蛋白尿組病兒尿液TG2水平為(0.249±0.039) μg/L,明顯低于無(wú)蛋白尿組的(0.388±0.074)μg/L,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.937,P<0.01)。

2.4 HSPN病兒尿液TG2水平與血清TG2水平及24 h尿蛋白定量的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示,HSPN病兒尿液TG2水平與血清TG2水平無(wú)相關(guān)性(r=0.12,P>0.05),而與24 h尿蛋白定量值呈負(fù)相關(guān)(r=0.89,P<0.05)。見(jiàn)圖1、2。

圖1 HSPN病兒尿液TG2水平與血清TG2水平的相關(guān)性

圖2 HSPN病兒尿液TG2水平與24 h尿蛋白定量相關(guān)性

2.5 尿液TG2水平對(duì)HSPN的診斷效能

本文ROC曲線分析結(jié)果顯示,尿液TG2水平診斷HSPN的曲線下面積為0.857,95%置信區(qū)間為0.767～0.948(P<0.01);HSP病兒尿液TG2診斷HSPN的最佳閾值為0.32 μg/L,此時(shí)其診斷靈敏度為0.795,特異度為0.892。見(jiàn)圖3。

3 討 論

HSP是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的以小血管炎為主要病變的系統(tǒng)性血管炎,可累及皮膚、胃腸道、關(guān)節(jié)、腎臟等多器官系統(tǒng),部分病兒腎臟損害遷延不愈,可導(dǎo)致不可逆腎臟病[4,9]。目前研究認(rèn)為,其發(fā)病機(jī)制以IgA介導(dǎo)的體液免疫為主,IgA1沉積于小血管壁引起的自身炎癥反應(yīng)和組織損傷在HSP發(fā)病中起重要作用,特別是IgA1糖基化異常及IgA1分子清除障礙在HSP的腎臟損害中起著關(guān)鍵作用,血清Gd-IgA1水平增高和大分子的Gd-IgA1-IgG循環(huán)免疫復(fù)合物沉積于腎臟可能是HSPN的重要發(fā)病機(jī)制[10]。增多的循環(huán)免疫復(fù)合物沉積于腎臟可能與兩種IgA受體即CD89和CD71有關(guān)[11]。可溶性CD89(sCD89)參與最初IgA免疫復(fù)合物的形成和(或)擴(kuò)增,隨后CD71介導(dǎo)IgA1免疫復(fù)合物在系膜區(qū)沉積。DAHA等[12]在其研究中提出IgA1免疫復(fù)合物在系膜區(qū)沉積導(dǎo)致腎小球損傷的可能機(jī)制:異常糖基化的單體Gd-IgA1或多聚體pGd-IgA1與抗Gd-IgA1分子的IgG抗體結(jié)合,形成Gd-IgA1-IgG,后者引起血液中單核細(xì)胞表面的CD89脫落,形成sCD89-Gd-IgA1-IgG復(fù)合物,隨后該免疫復(fù)合物由循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入腎臟,與CD71結(jié)合并在系膜區(qū)沉積,進(jìn)而誘導(dǎo)系膜細(xì)胞表面TG2的表達(dá),啟動(dòng)炎癥反饋通路,引起CD71持續(xù)活化,導(dǎo)致系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子過(guò)度產(chǎn)生,加重炎癥反應(yīng)及腎損傷。

康志娟等[13]研究結(jié)果顯示,HSPN病人血清及尿液中Gd-IgA1水平明顯升高,尿Gd-IgA1/肌酐比值與尿蛋白定量呈正相關(guān)。MORESCO等[14]研究結(jié)果顯示,IgA腎病和HSPN病人尿液TG2和CD89水平降低。DELANGHE等[15]研究表明,與其他類(lèi)型的腎小球病病人相比,IgA腎病和HSPN病人尿中CD71濃度更高,且與尿蛋白定量呈正相關(guān),提示尿液CD71有可能成為評(píng)估病人腎臟早期損傷的生物學(xué)標(biāo)志物。

TG2是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶家族中的一員,在人類(lèi)組織中分布廣泛,它分泌到細(xì)胞外可以通過(guò)催化酰胺基團(tuán)使很多細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成分之間發(fā)生交聯(lián),形成牢固結(jié)構(gòu),抵抗降解,促進(jìn)組織纖維化發(fā)展[16]。IKEE等[17]研究表明,IgA腎病病人腎小球系膜區(qū)腎臟組織中TG2表達(dá)水平與血肌酐、肌酐清除率、尿蛋白排泄、腎小球硬化和系膜細(xì)胞增殖相關(guān),推測(cè)TG2可能是腎小球損傷的初始標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示,HSPN組病兒尿液TG2水平明顯低于正常對(duì)照組及NHSPN組,這與MORESCO等[14]的研究結(jié)果相一致,證實(shí)HSPN病兒存在尿液TG2水平降低。綜合上述研究結(jié)果,我們推測(cè)尿液TG2通過(guò)與sCD89-Gd-IgA1-IgG、CD71之間的協(xié)同作用,參與了IgA1免疫復(fù)合物在腎小球的沉積及腎小球系膜細(xì)胞活化,導(dǎo)致HSP病兒的腎損害。本研究結(jié)果還顯示,有蛋白尿組HSPN病兒尿液TG2水平明顯低于無(wú)蛋白尿組,且尿液TG2水平與HSPN病兒24 h尿蛋白定量呈負(fù)相關(guān),提示尿液TG2水平與腎臟損害程度相關(guān),尿液TG2可以作為預(yù)測(cè)HSPN病兒腎臟損害嚴(yán)重程度的生物學(xué)指標(biāo)。

關(guān)于HSPN病兒尿中TG2水平下降的原因,我們推測(cè)以下兩方面共同導(dǎo)致了尿中TG2含量降低:一方面,在疾病活動(dòng)期,系膜區(qū)沉積含CD89、TG2、CD71和IgA1的多分子復(fù)合物,誘導(dǎo)促炎遞質(zhì)釋放,導(dǎo)致腎臟病變進(jìn)展,隨著這些多分子復(fù)合物在腎臟中的沉積和穩(wěn)定,TG2的腎臟排泄減少;另一方面,系膜區(qū)的炎癥反應(yīng)可能引起TG2的過(guò)度消耗。此外,本研究未發(fā)現(xiàn)HSPN組與NHSPN組及對(duì)照組血清TG2水平的差異。原因是否為其他部位(如皮膚、胃腸道)血管炎癥誘導(dǎo)TG2產(chǎn)生增多,抵消了腎臟部位TG2沉積所致,尚需做進(jìn)一步研究。腎活檢是評(píng)估HSPN嚴(yán)重程度和預(yù)后的金標(biāo)準(zhǔn),但臨床上由于各種原因,組織活檢率往往不高,迫切需要可靠的非侵入性生物標(biāo)志物用于HSPN的檢測(cè)。因此,本研究利用ROC曲線進(jìn)一步分析了尿液TG2水平對(duì)HSPN的診斷價(jià)值,結(jié)果表明,當(dāng)尿液TG2水平≤0.32 μg/L時(shí),HSP病兒并發(fā)腎臟損傷的可能性比較大。

綜上所述,HSPN病兒尿液TG2水平顯著下降,且與24 h尿蛋白定量呈負(fù)相關(guān)。尿液TG2可作為HSPN的生物學(xué)標(biāo)志物,對(duì)早期診斷和預(yù)測(cè)HSP并發(fā)腎損傷具有一定的指導(dǎo)意義。