基于網絡藥理學和生物信息學的大柴胡湯治療2型糖尿病作用機制探討

孫昊,馬平,崔楠,于慶潭,崔靜

(1 海軍青島特勤療養中心醫訓部,山東 青島 266071; 2 青島市第三人民醫院麻醉科; 3 青島大學附屬醫院醫院管理研究所;4 海軍青島特勤療養中心療養五區檢驗科; 5 青島市疾病預防控制中心/青島市預防醫學研究院)

2型糖尿病(T2DM)是一種慢性代謝紊亂性疾病,我國T2DM病人高達1.14億,居世界首位[1]。中醫臨床上常用大柴胡湯治療T2DM[2-3]。大柴胡湯可以通過調節IRS-1/PI3K/Akt通路活性、糖脂代謝和抑制氧化應激反應來減輕胰島素抵抗,從而發揮治療T2DM 的作用[4-6]。本研究采用網絡藥理學與生物信息學相結合的方法,分析大柴胡湯治療T2DM的潛在分子生物學機制,探討大柴胡湯臨床治療T2DM的藥效機制,為該方的藥理學機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 大柴胡湯活性成分與作用基因的挖掘

通過在線中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP)(https://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索大柴胡湯的相關蛋白。以大柴胡湯的藥物組成為檢索詞,將口服生物利用度(OB)≥40%和藥物相似性(DL)≥0.20的藥物成分相關的蛋白質納入研究,然后將納入的蛋白質通過蛋白質數據庫(UniProt)(https://www.uniprot.org/)規范為相應的基因。

1.2 T2DM相關基因的篩選

T2DM的相關基因以“‘Type 2 diabetes’and ‘Homo sapiens’ [porgn:_txid9606] and ‘series’ and ‘expression profiling by array’”在PubMed的基因表達數據庫(GEO數據庫)中檢索,共檢索到140個可能相關的基因芯片,通過GEO2R對含有T2DM與非T2DM樣本的基因芯片進行中位數標準分析,導出T2DM與非T2DM分別處于同一水平的基因樣本,將調整后P<0.05且|log10(FC)|>1的基因納入到本研究。

1.3 大柴胡湯治療T2DM的相關靶點基因的篩選

Jvenn在線網站(http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/index.html)是一個用維恩圖比較列表的交互式在線工具。將大柴胡湯的作用靶點基因與T2DM關聯的基因均導入Jvenn在線網站,最后獲得大柴胡湯治療T2DM的相關靶點基因。

1.4 “復方-藥材-組分-靶點-疾病”網絡構建與分析

采用Cytoscape 3.8.2軟件,通過復方、復方藥材、部分藥材組分、靶點基因以及T2DM構建“復方-藥材-組分-靶點-疾病”網絡,以明確大柴胡湯治療T2DM的關鍵成分、靶點。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

將大柴胡湯治療T2DM的相關靶點基因導入到Metascape在線分析軟件中(http://metascape.org/)進行GO功能和KEGG通路富集分析。其中GO生物學進程(BP)、KEGG通路、Reactome基因組等數據庫是Metascape在線分析軟件富集分析的主要來源。Metascape在線分析軟件將基因數≥3個、富集因子>1.5且P<0.01的相似GO功能和KEGG通路進行富集分簇分析。富集分析的P值采用累積的超幾何分布計算[7];q值采用多次Banjamini-Hochberg過程計算[8];層次聚類分析采用Kappa分數,相似度>0.3的視為同一簇[9]。

1.6 蛋白互作網絡分析

采用Metascape在線軟件的分子復合物檢測法對大柴胡湯治療T2DM的相關靶點基因進行模塊分析,Metascape在線軟件將每個模塊的靶點基因分別進行GO功能和KEGG通路分析,并將P值從小到大排列后前3位的GO功能和KEGG通路進行描述。

2 結 果

2.1 大柴胡湯藥物活性成分與靶基因篩選

通過TCMSP在線數據庫平臺獲得大柴胡湯的藥物活性成分,獲得大柴胡湯中OB≥40%和DL≥0.20的藥物活性成分98個,其中柴胡12個、黃芩18個、芍藥16個、半夏5個、生姜2個、枳實16個、大棗16個、大黃11個,黃芩苷、豆甾醇、槲皮素、圣草酚(黃烷酮)等6個藥物活性成分在組方藥材2味及以上中藥中所含有。利用TCMSP在線軟件,獲得大柴胡湯的相關靶點蛋白后,通過Uriprot數據庫將靶蛋白規范為相應的靶基因名稱,剔除重復基因后,最終564個靶基因被納入到本研究中。

2.2 T2DM相關基因的篩選

GEO數據庫中共檢索到18套與T2DM相關的基因芯片,18套基因芯片中調整后P<0.05且|log10(FC)|>1的T2DM相關基因共11 641個。

2.3 大柴胡湯治療T2DM的相關靶點基因篩選

將大柴胡湯的作用靶點基因與T2DM關聯的基因導入到Jvenn在線網站中,得到大柴胡湯治療T2DM的相關靶點基因136個,見圖1。大柴胡湯復方-藥材-組分-靶點-T2DM網絡圖見圖2。表明大柴胡湯的有效藥物成分可能通過影響機體的基因而達到治療疾病的作用。

圖1 大柴胡湯治療T2DM的相關靶點基因

圖2 大柴胡湯復方-藥材-組分-靶點-T2DM網絡圖

2.4 大柴胡湯治療T2DM相關靶點基因的GO功能和KEGG通路富集分析

采用Metascape在線軟件將136個大柴胡湯治療T2DM的相關靶點基因進行富集分析,GO功能和KEGG通路富集分析結果顯示20個功能簇。大柴胡湯可影響機體對無機物的應答(BP)、脂多糖的應答(BP)、氧化應激反應(BP)、對有機環化合物的細胞反應(BP)、激素刺激的細胞反應(BP)、細胞外刺激的應答(BP)、凋亡信號通路(BP)、活性氧代謝通路(BP)、TNF信號通路(KEGG通路)、細胞死亡的正向調節(BP)、細胞衰老(KEGG通路)、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調節(BP)、脂肪酸代謝進程(BP)等BP與信號通路來治療T2DM。見圖3和表1。

表1 大柴胡湯治療T2DM靶基因的富集分析

圖3 大柴胡湯治療T2DM靶基因的富集分析圖

2.5 大柴胡湯治療T2DM相關靶點基因的蛋白互作網絡分析

采用Metascape在線軟件將136個大柴胡湯治療T2DM的相關靶點進行蛋白互作網絡分析,大柴胡湯治療T2DM的相關靶點蛋白共有5個Mcode模塊,包含5個以上蛋白的模塊有4個,見圖4和表2。最復雜模塊是模塊1,包含19個蛋白,其功能主要集中在蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調節、PID-ATF2通路等;模塊2包含15個蛋白,主要集中在凋亡信號通路、凋亡過程的正調控、程序性細胞死亡的正調節等功能;模塊3和模塊4分別包含8個蛋白,分別主要集中在胰腺癌、內分泌抵抗與胺受體配體結合、鈣信號通路等BP。

表2 大柴胡湯治療T2DM靶基因的蛋白互作網絡分析

圖4 大柴胡湯治療T2DM的相關靶點蛋白互作網絡分析圖

2.6 影響Mcode模塊的藥物

大柴胡湯中作用于模塊1的藥物有柴胡、黃芩、枳實、大黃、芍藥、生姜、大棗等;作用于模塊2的藥物有柴胡、枳實、大黃、芍藥、大棗等;作用于模塊3的藥物有柴胡、黃芩、枳實、大黃、半夏、生姜、大棗等;作用于模塊4的藥物有柴胡、大黃、枳實、大棗等;作用于模塊5的藥物有柴胡、黃芩等。

3 討 論

T2DM的發生多是由于病人過食肥甘厚味,導致胃熱、肝熱或者肝胃俱熱。大柴胡湯由柴胡、黃芩、大黃、枳實、芍藥、半夏、生姜、大棗等組成,主要起到和解少陽、內瀉熱結的功效,王國斌與仝小林均運用大柴胡湯治療T2DM[2,10]。本研究結果顯示,大柴胡湯中OB≥40%和DL≥0.20的藥物活性成分98個,得到大柴胡湯治療T2DM的相關靶點基因136個。基因/蛋白富集分析結果顯示,大柴胡湯治療T2DM的靶點基因,其BP與信號通路主要集中在對無機物的應答、脂多糖的應答、氧化應激反應、激素刺激的細胞反應、細胞外刺激的應答、凋亡信號通路、活性氧代謝通路、TNF信號通路、細胞死亡的正向調節、細胞衰老、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調節、脂肪酸代謝進程、鈣信號通路等。說明大柴胡湯可能通過影響氧化應激反應、脂肪酸代謝進程、活性氧代謝通路等BP與信號通路來治療T2DM。有研究結果表明,大柴胡湯中能提取黃芩苷、芍藥苷[11-12],而黃芩苷能夠激活胰島素受體底物-1和葡萄糖轉運蛋白-4,并能激活AMPK-PI3K/Akt與MAPK/ERK信號通路,進而有效地刺激機體葡萄糖的吸收[11,13-17],這與本研究結論一致。大柴胡湯提取物治療四氯化碳中毒導致的急性肝損傷大鼠的研究發現,大柴胡湯能預防超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽還原酶等活性氧代謝損傷[18-19],而氧化應激已被認為是T2DM發生發展的關鍵因素,并最終導致脂質過氧化[20-24],這與本研究中大柴胡湯治療T2DM相關靶點基因富集于氧化應激反應、活性氧代謝通路等結論一致。動物實驗發現,大柴胡湯可以抑制胰腺脂肪酶的活性,進而降低三酰甘油、膽固醇和游離脂肪酸等血脂指標的水平[25-27]。T2DM是一種典型的脂代謝紊亂性疾病,目前研究顯示該病和三酰甘油、總膽固醇、游離脂肪酸等脂肪酸代謝密切相關[28-31]。這與本研究中大柴胡湯治療T2DM相關靶點基因富集于脂肪酸代謝進程等結果一致。

本研究還顯示,大柴胡湯治療T2DM的靶點基因主要集中在對無機物的應答、激素刺激的細胞反應、凋亡信號通路、TNF信號通路、細胞死亡的正向調節、細胞衰老、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調節等BP與信號通路,而T2DM與上述BP和通路均相關,研究大柴胡湯與上述BP和通路的關系是今后大柴胡湯治療T2DM的研究方向。大柴胡湯不同的藥物組成作用在不同的模塊上,也為今后探討臨床用藥的藥理學機制與各種藥物組成在臨床中發揮協同作用提供新的研究思路,為中西醫的融合發展起到促進作用。

綜上所述,本研究發現大柴胡湯能夠通過影響脂多糖的應答、細胞外刺激、氧化應激反應、活性氧代謝通路、脂肪酸代謝等生物學通路來影響胰島細胞的分泌和降低血脂指標,達到清泄“肝胃郁熱”的作用,從而使T2DM病人的血糖降低。通過動物和(或)細胞實驗將網絡藥理學與生物信息學預測的結果進行驗證是我們的下一步研究方向。