原發性膽汁性膽管炎病人咽漱液中EB病毒分型

吳海梅,趙真真,周永,薛楓,辛永寧,宣世英

(1 南京醫科大學附屬青島市市立醫院感染科,山東 青島 266071; 2 南京醫科大學附屬青島市市立醫院臨床研究中心;3 青島市第六人民醫院感染科)

EB病毒(EBV)是皰疹病毒科嗜淋巴細胞屬成員,感染了世界上95%以上的人口,且與多種自身免疫性疾病有關[1-3]。原發性膽汁性膽管炎(PBC)的發病機制尚不清楚,但該病本質上是自身免疫性疾病[4]。有研究發現,PBC與EBV感染之間存在關聯[5-7]。EBV相關疾病的分布具有明顯的地域差異,提示不同地區的EBV流行株可能有序列及生物學功能上的差異。EBV最常見的分型方式為基于EBV核抗原(EBNA)2、3A、3B及3C的抗原性及基因序列而區分的1/2分型。多數研究認為,1/2分型具有地域相關性,也有研究顯示EBV-2型感染可能與鼻咽癌(NPC)發生有關[8]。而基于EBNA1的基因序列,亦可以將其劃分為5種亞型:P-ala、P-thr、V-val、V-leu和V-pro。該分型方式同樣具有疾病特異性[9]。本研究首次對PBC病人咽漱液中EBV進行1/2分型檢測及EBNA1的多態性分析,旨在確定EBV的基因亞型與PBC疾病相關性。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 標本采集及DNA提取

收集青島市市立醫院及青島市第六人民醫院收治的54例PBC病人的咽漱液標本,病人籍貫均為山東省并且長期居住在青島市。PBC診斷參照《原發性膽汁性膽管炎的診斷和治療共識(2021)》的標準[10]。排除標準:①合并自身免疫性肝炎、原發性硬化性膽管炎、IgG4相關性肝膽疾病等其他自身免疫性肝病的病人;②合并甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等嗜肝性病毒感染,或人免疫缺陷病毒、巨細胞病毒等非嗜肝性病毒感染的病人。健康人群咽漱液標本均來自在山東省居住的健康成年人群。取30 mL無菌生理鹽水漱口1 min后采樣,標本采集后采用江蘇康為世紀公司的通用式組織DNA抽提試劑盒抽提細胞DNA。

1.2 EBV 1/2分型檢測

參考SAMPLE等[11]的報道設計PCR引物,擴增EBNA3C序列(表1)。取5 μL PCR擴增產物于含溴化乙錠的20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳,凝膠成像系統記錄電泳結果。每次PCR反應均用無酶雙蒸水作陰性對照。PCR反應體系及反應條件參考ZHAO等[12]的文獻。

表1 EBV 1/2分型及EBNA1基因序列多態性檢測所用引物序列

1.3 EBNA1基因序列多態性檢測

1.3.1PCR擴增 依據B95-8原型株序列,參考ZHAO等[12]的報道設計擴增EBNA1基因的引物,引物序列及PCR產物長度見表1。采用巢式PCR擴增EBNA1C-末端AA404-641(nt109159-109875)之間的序列,EBNA1-1、EBNA1-2為第1輪擴增引物,EBNA1-3、EBNA1-4為第2輪擴增引物。取第1次PCR擴增產物5 μL作為第2次PCR的模板,PCR反應體系及條件參考相關文獻[12]。每次PCR反應均設水對照。取5 μL PCR產物置于15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳。

1.3.2測序分析 取上述PCR產物25 μL送北京華大基因有限公司進行測序,采用Snapgene軟件查看所獲序列峰圖文件,利用DNAStar軟件(Larsergene,version 7.0)進行序列剪接和對比分析,并在美國國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫中與B95-8原型株(GenBank登錄號V01555)序列進行對比分型。采用BHATIA等[13]和GUTIéRREZ等[14]的分類方法,以AA487為特征性AA,結合其他共有突變對序列將EBNA1基因分為P-ala、P-thr、V-val、V-leu和V-pro 5種亞型,將具有相同共有突變的序列歸為1種變異類型。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 EBV感染率與1/2分型

本文54例病人標本中均檢出EBV感染,感染率為100%,其中1型EBV感染31例(57.4%),2型EBV感染19例(35.2%),1+2型EBV混合感染4例(7.4%)。圖1為部分標本EBNA3C片段PCR產物電泳結果。健康人群EBV 1/2分型結果:1型EBV感染45例(45/57,78.9%),2型EBV感染10例(10/57,17.6%),1+2型混合感染2例(2/57,3.5%)[15]。將1+2型EBV感染病人與2型EBV感染病人合并進行統計分析,結果顯示,PBC病人2型EBV感染率(23/54,42.6%)明顯高于健康人群(12/57,21.1%),差異具有統計學意義(χ2=5.959,P=0.015,OR=2.782,95%CI=1.208～6.410)。

注:EBNA3C片段PCR產物153 bp者為EBV-1型,246 bp者為EBV-2型,同時出現153 bp和246 bp者為1+2型EBV混合感染。1～10為PBC樣本,其中1、2、7、9為EBV-1型,3、4、6、8為EBV-2型,5、10為1+2型EBV混合感染;11～13為對照,其中11為無酶雙蒸水對照,12為EBV-1型(B95-8細胞)對照,13為EBV-2型(P3HR1細胞)對照。

2.2 EBV 1/2分型與PBC病人臨床特征關系

EBV-2型病人直接膽紅素(DBil)異常升高比例顯著高于EBV-1型(χ2=9.714,P=0.002);EBV-1型PBC病人與EBV-2型PBC病人之間性別、年齡、體質量指數(BMI)以及總膽紅素(TBil)、間接膽紅素(IBil)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉移酶(GGT)、總膽汁酸(TBA)等肝功能指標比較,差異均無顯著性(P>0.05)。見表2。

表2 EBV 1/2分型與PBC病人臨床特征的關系(例)

2.3 EBNA1基因序列多態性

2.3.1EBNA1C端序列變異類型 本研究成功擴增52例PBC病人的EBNA1片段,共檢出4種變異類型:P-ala、P-thr、V-val和V-leu。有5份PBC病人標本在用Snapgene軟件查看峰圖序列時發現AA487等共有突變位點出現超過1種亞型的特征性突變,經反復測試最后鑒定為混合感染。其中有2份標本為P-thr+V-leu混合感染,1份標本為V-val+P-thr混合感染,1份標本為V-val+V-leu混合感染,1份標本為P-thr+P-ala混合感染。

2.3.2EBNA1亞型在PBC病人和健康人群中的分布 在PBC病人標本中最多見的變異類型為P-thr變異型(27/52,51.9%),其次為V-val變異型(18/52,34.7%)。在健康人群中最多見的變異類型為V-val變異型(34/55,61.8%)[15]。P-thr攜帶者(31/52,59.6%)在PBC病人中所占比例明顯高于健康人群(18/55,32.7%)(χ2=8.290,P=0.004,OR=3.253,95%CI=1.440～7.347)。見表3。

表3 EBNA1亞型在PBC病人和健康人群中的分布(例(χ/%))

2.3.3EBNA1亞型與1/2分型的關系 EBV-1型病人主要的EBNA1亞型為V-val和P-thr,共占96.2%(26/27),EBV-2型病人主要的EBNA1亞型為P-thr,占64.7%(11/17)。EBV-1型與EBV-2型PBC病人之間EBNA1亞型的分布差異無顯著性(χ2=3.858,P=0.277)。見表4。

表4 EBNA1亞型與1/2分型的關系(例(χ/%))

2.3.4EBNA1基因序列多態性與PBC病人臨床特征關系 P-thr、V-val 2種EBNA1亞型病人之間性別、年齡、BMI及肝功能指標比較,差異均無顯著性(P>0.05)。見表5。

表5 P-thr、V-val亞型與PBC病人臨床特征的關系(例)

3 討 論

PBC是一種慢性的自身免疫性疾病,其病因是免疫介導的小膽管進行性破壞,其典型特征是血清中存在抗線粒體抗體。PBC病人的肝臟和唾液樣本中均存在EBV-DNA水平升高[5-6]。MORSHED等[6]研究結果顯示,有61%的PBC病人外周血單個核細胞中EBV-DNA水平增加,而在健康對照組中僅有11%。BARZILAI等[7]研究結果表明,PBC病人EBV早期抗原IgG滴度升高。以上研究均提示PBC的發生發展可能與EBV感染有關。

本研究共納入54例PBC病人,其EBV感染率為100%。全世界95%以上的健康成人攜帶EBV,最新的研究顯示,美國、巴西、墨西哥成年男性EBV平均感染率為97.3%[16]。本研究所有PBC病人均感染EBV,這可能與本研究納入人群年齡較大,感染風險隨著年齡增長亦增高有關。

1型EBV是世界范圍內的優勢流行株,而2型EBV主要在非洲地區感染率較高[17]。本研究PBC病人咽漱液標本中2型EBV的檢出率明顯高于健康人群,提示2型EBV感染可能與PBC有關。在體外1型EBV比2型EBV更加容易轉化初始B淋巴細胞,而2型EBV由于細胞活化T細胞核因子(NFAT)c1/c2轉錄因子活性的增加以及EBV即刻早期蛋白(BZLF1)啟動子Zp-V3的普遍存在導致受感染B細胞有更高的裂解能力[18-19]。有人推測2型EBV可能在免疫系統紊亂病人中更常見[17]。這提示EBV-2型與免疫功能有關,也部分解釋了PBC病人中EBV-2型感染比例更高的原因。

V-val型是北方地區最多見的EBNA1變異類型。而本研究PBC病人中所占比例最高的則是P-thr型,且PBC病人P-thr型所占比例顯著高于健康人群。有研究結果表明,V-val變異型EBNA1比B95-8原始株有更高的轉錄活性以及維持宿主細胞存活的能力,且來自不同地域的EBV相關胃癌(EBVaGC,日本和美國)及NPC(中國北方)的結果均顯示V-val為EBNA1主要亞型[9]。提示PBC病人的P-thr分型比例增高具有疾病特異性,P-thr亞型可能與PBC具有相關性。EBV表位的分子擬態導致對自身抗原的耐受性喪失以及表位傳播可能是EBV導致自身免疫疾病發生與發展的機制之一[20]。在動物實驗中,用EBNA1DNA免疫不僅可以產生抗EBNA1抗體,還可以產生自身抗體并導致狼瘡樣自身免疫性疾病[21]。EBNA1蛋白功能區域如DNA結合-二聚化部位(AA452-607)、轉錄激活部位(AA325-376、AA65-89)、USP7結合部位(AA442-459)等均位于C-末端[22],因此EBNA1 C端的突變可能對其功能產生影響。例如有研究發現,EBNA1DNA結合域的氨基酸改變導致NPC細胞中DNA的復制能力受損,EBNA1的AA325-376缺失可以影響其轉錄激活的功能[23]。故推測EBNA1序列多態性可能通過改變病毒DNA復制、轉錄等功能參與疾病發生發展[24]。EBNA1在誘導自身免疫反應等方面具有重要作用,而P-thr亞型中大多數突變位點位于功能區域,今后需對該亞型繼續深入研究,進一步闡明其在PBC發生發展過程中的作用與機制。

EBV-2型PBC病人DBil異常升高比例顯著高于EBV-1型病人,而EBV-1型與EBV-2型PBC病人之間性別、年齡、BMI和除外DBil的肝功能指標差異均無顯著性。機體膽紅素濃度升高可以抑制細胞核因子κB(NF-κB)信號通路激活,從而誘導炎癥因子的表達和加重炎癥反應,并可以引起脂質過氧化損傷[25]。DBil為PBC病人臨床治療中常用的反映肝功能的指標,其異常升高與病人臨床癥狀及預后有關[10,26]。因此我們認為,EBV-2型感染與PBC病人的肝損傷有關,其具體機制還有待進一步研究。

綜上,2型EBV感染及P-thr變異型攜帶可能與PBC相關,2型EBV感染與PBC病人的DBil異常升高有關。由于PBC患病率較低,標本較難收集,盡管滿足統計需求,但本研究納入樣本例數仍較少,后續尚需擴大樣本量進一步研究。