薯蕷皂苷對煙曲霉菌性角膜炎的作用及其機制

綦英合,尹敏,劉桂波,李翠

(青島大學附屬醫院眼科,山東 青島 266003)

真菌性角膜炎(FK)是一種由病原真菌引起的頑固性角膜疾病,如果治療不當會引起角膜潰瘍、穿孔甚至失明[1]。由于工農業生產導致眼外傷、術后角膜感染、隱形眼鏡的佩戴以及類固醇激素的濫用,FK的發病率越來越高[2]。FK的嚴重程度與真菌病原體的毒力和宿主防御機制密切相關[3]。一方面,真菌病原體的孢子侵入眼表,對角膜組織造成物理損傷,同時分泌毒力因子進一步破壞角膜結構[4];另一方面,真菌病原體侵入角膜會引發強烈的免疫反應,誘導免疫細胞積累,進一步促進促炎細胞因子的產生,導致角膜潰瘍的延遲愈合[5]。因此,抗真菌聯合抗炎治療是快速改善FK的關鍵。最近,中藥治療真菌感染引起了國內外的廣泛關注。薯蕷皂苷(DS)是一種從薯蕷、穿山龍、閉鞘姜等多種植物根莖中分離提取的天然化合物,具有毒性低、資源豐富等優點[6]。藥理學研究證明DS具有抗腫瘤、抗炎、抗真菌和降血脂等多種藥理作用[7-10]。有研究發現,DS通過破壞真菌細胞膜的完整性導致細胞內離子外流、細胞膜電位和細胞內滲透壓發生改變,對白色念珠菌具有良好的抗菌活性[11],然而其是否對煙曲霉菌(AF)有作用目前尚不清楚。RAN等[12]研究顯示,DS通過激活核因子-紅細胞2相關因子2(Nrf2)信號通路,減少炎癥細胞浸潤,并抑制白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等炎癥因子的表達和分泌,從而改善炎癥反應。本研究擬通過體內和體外實驗探究DS在AF性角膜炎中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 DS溶液的制備和AF培養

用精密電子天平稱量32 μg的DS加入至1 μL的DMSO中,然后用無菌PBS將該混合物稀釋至1 mL,得到32 mg/L的 DS儲存溶液,之后再用DMEM培養液將其稀釋至所需濃度。參考相關文獻的方法[13],將AF株(NO3.0772,中國北京微生物中心)接種于沙氏液體培養基中,37 ℃孵育48 h,收集菌絲洗滌、離心、棄上清,將部分真菌活菌絲用于動物實驗;另一部分用體積分數0.75的乙醇處理作為滅活菌絲用于細胞實驗。所有菌絲均用DMEM培養液和無菌PBS稀釋至3×108CFU/L。

1.2 細胞培養及處理

將RAW264.7細胞(購自中國科學院上海細胞庫)接種于12孔板中,在37 ℃、體積分數0.05 CO2的條件下進行培養,隨機分為溶劑對照組(A組)、DS處理組(B組)、單純加菌組(C組)和加菌DS處理組(D組),每組設置6個復孔。待細胞密度約為80%時,向溶劑對照組和單純加菌組每孔加入1 mL體積分數0.000 1 的DMSO;DS處理組、加菌DS處理組每孔加入16 mg/L的 DS溶液1 mL,刺激1 h,再向單純加菌組和加菌DS處理組每孔加入滅活菌絲60 μL,6 h后收集細胞用于實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)。

1.3 DS毒性測定

1.3.1CCK-8實驗 將RAW264.7細胞接種于96孔板中,實驗組用不同濃度的DS溶液(1、2、4、8、16和32 mg/L)處理,對照組用體積分數0.000 1 的DMSO處理,每組設置6個復孔。37 ℃培養48 h后,每孔中加入10 μL CCK-8試劑并繼續在37 ℃條件下培養1 h。使用酶標儀(ViCTOR Nivo 5s,PerkinElmer,美國)檢測450 nm波長處的吸光度值,以其作為細胞存活率的指標。

1.3.2Draize眼表毒性實驗 取12只健康的8周齡C57BL/6雌性小鼠(購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司),隨機分為實驗組和對照組,每組6只。實驗組小鼠的右眼用16 mg/L的DS溶液點眼處理,對照組則用體積分數0.000 1的DMSO點眼處理,每日4次。于點眼后的第1、3天進行角膜熒光素鈉染色,并在裂隙燈下使用鈷藍光進行拍照記錄。觀察小鼠角膜的染色程度。

1.4 體外抗真菌實驗

1.4.1菌絲形態及真菌細胞結構觀察 將濃度為3×108CFU/L的煙曲霉分生孢子接種在6孔板上,37 ℃下培養24 h。應用PBS洗滌3次,離心10 min后轉移至新的6孔板中,并向每孔中加入16 mg/L的DS或體積分數0.000 1 DMSO溶液培養12 h。PBS洗滌后,用體積分數0.025的戊二醛固定。采用相關文獻的方法[14],通過包埋、脫水、干燥處理固定菌絲。用JSM-840掃描電子顯微鏡(JOEL,日本)以1 000倍和5 000倍的放大倍數拍攝照片,用JEM-1200EX透射電子顯微鏡(JOEL,日本)以25 000倍的放大倍數拍攝照片,觀察菌絲形態以及真菌細胞結構。

1.4.2碘化丙啶(PI)攝取實驗檢測AF細胞膜完整性 將濃度為3×108CFU/L的煙曲霉分生孢子接種在6孔板上,37 ℃下培養24 h。PBS洗滌3次,離心10 min后轉移至新的6孔板中,并向每孔中加入16 mg/L 的DS或體積分數0.000 1 DMSO溶液培養12 h。PBS沖洗菌絲,向每孔中加入50 mg/L的 PI溶液。隨后將孔板避光靜置15 min。使用Axio-Vert顯微鏡(Zeiss,Oberkochen,德國)在200倍放大倍數下獲取圖像。觀察不同處理組的熒光強度,以其反映AF細胞膜完整性。

1.5 qRT-PCR檢測Nrf2及細胞因子的mRNA表達

使用RNAiso Plus試劑盒(Takara Biotechno-logy,中國大連)提取細胞總RNA,按試劑盒說明書進行操作,并使用分光光度計對結果進行定量。以提取的mRNA為模板,使用PrimeScript RT試劑盒(Vazyme)通過兩步法合成cDNA。按照相關文獻報道的方法[13],使用梯度熱循環儀(Eppendorf MasterCycler)和TB Green預混物(Vazyme)進行qRT-PCR,檢測細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和Nrf2的mRNA表達,以β-actin作為內參照。根據循環數計算基因的相對表達量。PCR所用引物及其序列見表1。

表1 PCR引物及其序列

1.6 小鼠AF性角膜炎模型的建立及角膜感染情況的觀察

將24只C57BL/6小鼠隨機分為DMSO溶劑對照組(對照組)和DS組,每組12只。用80 g/L的水合氯醛對小鼠腹腔注射麻醉后,刮除小鼠右眼直徑約2 mm的中央角膜上皮,將5 μL AF活菌絲涂于刮除處,然后放置直徑為3 mm的角膜接觸鏡,縫合眼瞼。24 h后通過裂隙燈顯微鏡確認小鼠AF性角膜炎模型建立成功后,在右眼結膜下注射體積分數0.000 1 DMSO或16 mg/L的DS溶液,每天2次。建立模型后的第1天和第3天通過裂隙燈顯微鏡觀察小鼠角膜情況,按照相關文獻方法評估角膜炎的嚴重程度[15],分為Ⅰ～Ⅳ級。于感染后的第3天處死小鼠,每組收集6只小鼠角膜進行平板菌落計數[16],收集另外6只小鼠眼球進行蘇木精-伊紅(HE)染色[5],觀察小鼠角膜的真菌存活數量及炎癥細胞浸潤程度。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 DS對RAW264.7細胞和小鼠角膜的毒性

CCK-8實驗表明,DS濃度為0、1、2、4、8、16、32 mg/L時,細胞存活率分別為(100.00±4.19)%、(96.25±5.53)%、(94.32±7.85)%、(94.43±9.34)%、(93.93±7.32)%、(92.81±5.67)%和(45.76±9.03)%,DS濃度≤16 mg/L不會影響RAW274.7細胞的活力(P>0.05),而32 mg/L的DS溶液處理組細胞存活率與其他處理組比較差異有統計學意義(F=39.01,P<0.01)。Draize眼表毒性實驗結果顯示,用16 mg/L的 DS點眼處理第1天和第3天小鼠角膜均無著染(圖1)。因此,選用16 mg/L 的DS溶液用于后續實驗。

2.2 DS對AF的影響

掃描電子顯微鏡觀察顯示,與DMSO組相比,DS組的菌絲皺縮、卷曲、質地粗糙(圖2A～D)。透射電子顯微鏡觀察顯示,與對照組相比,DS組真菌細胞質變得透明、細胞器和核膜溶解(圖2E、F)。PI攝取實驗顯示,DS組的熒光強度明顯高于DMSO組(圖2G、H)。

A、B:DMSO組和DS組1 000倍掃描電子顯微鏡圖像;C、D:DMSO組和DS組5 000倍率掃描電子顯微鏡圖像;E、F:DMSO組和DS組25 000倍率透射電子顯微鏡圖像;G、H:DMSO組和DS組200倍率PI染色熒光圖像。

2.3 DS對AF誘導的炎癥因子及Nrf2 mRNA表達的影響

析因設計方差分析結果顯示,DS處理(FDS=20.06～56.13,P<0.001)、滅活菌絲處理(FAF=467.65～1 355.97,P<0.001)、DS與滅活菌絲處理產生的交互效應(FDS×AF=23.44～71.12,P<0.001)對各因子mRNA表達的影響差異均有統計學意義。單獨效應分析顯示,不經滅活菌絲處理時,DS處理和不處理對各因子mRNA的表達均無影響(P>0.05);經滅活菌絲處理時,DS處理較不處理各因子mRNA表達水平明顯降低(F=40.31～126.81,P<0.001)。見表2。

表2 各組細胞TNF-α、IL-1β、IL-6和Nrf2 mRNA表達水平比較

2.4 DS對AF小鼠模型角膜炎的作用

體內實驗裂隙燈觀察顯示,感染后的第1天,DS組與對照組的角膜炎嚴重程度無明顯差異(圖3A、B);感染后的第3天,與對照組相比,DS組小鼠角膜混濁面積減小,潰瘍程度減輕(圖3C、D)。HE染色結果顯示,與對照組相比,DS組的炎癥細胞明顯減少,組織結構更加有序(圖3E、F)。重復測量設計的方差分析顯示,時間、組別、時間和組別的交互作用對小鼠角膜炎癥臨床評分的影響差異有顯著性(F時間=51.05,F組別=11.99,F時間×組別=8.39,P<0.001);單獨效應結果顯示,兩組小鼠感染第1天臨床評分差異無顯著性(P>0.05),感染后的第3天DS組小鼠較對照組臨床評分顯著降低(F=18.27,P<0.001),對照組和DS組感染后第3天較第1天臨床評分均有所升高(F=50.41、9.02,P<0.001)。見表3。平板菌落計數實驗顯示,DS組感染角膜中的AF數量較對照組顯著減少(圖3G、H);對照組和DS組的菌落計數結果分別為411.40±29.59、76.00±7.14,兩組比較差異有統計學意義(t=8.78,P<0.05)。

A、B:對照組和DS組小鼠感染后第1天的裂隙燈圖像;C、D:對照組和DS組小鼠感染后第3天的裂隙燈圖像;E、F:對照組和DS組小鼠感染后第3天的HE染色觀察,放大倍數400倍;G、H:對照組和DS組小鼠感染后第3天的角膜真菌負荷照片。

表3 小鼠AF性角膜炎模型臨床評分比較

重復測量設計的方差分析顯示,F時間=51.05,F組別=11.99,F時間×組別=8.39,P<0.001。單獨效應分析顯示,與對照組比較,*F=18.27,P<0.001;與第1天比較,#F=50.41、9.02,P<0.001。

3 討 論

FK是一種致盲性角膜疾病,其難治性可能與致病真菌毒力和機體過度的免疫反應有關[17]。真菌分生孢子黏附于角膜上皮后,孢子開始萌發并且逐漸形成菌絲,發育中的菌絲通過自身的生長穿過上皮層并進入基質層,對角膜造成物理損傷[18]。此外,真菌還能夠產生毒性因子(如磷脂酶和蛋白酶等),這些因子可以通過降解角膜組織提高真菌的侵襲性[19]。真菌侵襲角膜激活了由免疫細胞和促炎細胞因子組成的信號網絡以清除病原體[20]。既往研究顯示,過度的免疫反應不僅對病原體的清除沒有幫助,反而會導致感染部位炎癥細胞和細胞毒性物質的大量積累,從而造成組織損傷、預后不良[21]。因此,抗真菌聯合抗炎治療尤為重要。

DS是一種廣泛存在于薯蕷科植物根莖中的天然甾體皂苷,具有抗真菌和抗炎作用[8-9]。本研究結果顯示,16 mg/L的DS對RAW264.7細胞和小鼠角膜無毒性作用;體外抗真菌實驗結果表明,DS通過破壞AF細胞膜、細胞器等結構,對真菌細胞造成不可逆的傷害,從而對AF起到明顯的抑制作用。CHO等[11]研究顯示,DS侵入真菌細胞膜后破壞膜內結構,導致真菌細胞死亡,從而發揮抗真菌活性。本文研究結果與其一致。為探究DS的體外抗炎作用,本文采用qRT-PCR方法檢測了DS對AF誘導的小鼠巨噬細胞炎癥反應的影響,結果表明,DS可以顯著抑制TNF-α、IL-1β及IL-6mRNA的表達。TNF-α、IL-1β及IL-6是參與角膜抗真菌免疫反應的重要促炎細胞因子,主要由活化的單核細胞產生,介導急性炎癥反應,促使免疫細胞產生更多的炎癥因子,從而對角膜組織造成更嚴重的破壞[22-23]。DS抑制這些促炎因子的基因表達,說明其可以抑制炎癥、縮短病程。Nrf2是重要的抗氧化調節因子,它可以通過阻斷TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子的基因表達抑制巨噬細胞的炎癥反應[24]。既往研究表明,Nrf2在促進角膜傷口愈合中起重要作用,激活的Nrf2在外傷性角膜疾病中可以發揮良好的保護作用[25]。本研究結果顯示,DS組Nrf2mRNA水平相較于對照組明顯升高,說明DS可能通過提高Nrf2的表達抑制炎癥反應,減輕角膜受到炎癥反應的傷害。

為進一步驗證DS的作用,本文建立了AF性角膜炎小鼠模型并進行了體內實驗。結果顯示,與對照組相比,DS組小鼠角膜炎嚴重程度明顯得到改善,臨床評分顯著降低,說明DS可以有效降低小鼠角膜炎癥指數,改善感染所引起的角膜潰瘍。此外,HE染色結果也表明,DS可以減少炎癥細胞的浸潤、減輕小鼠角膜的炎癥反應。WANG等[26]研究顯示,DS可以減輕LPS誘導的急性肺損傷所導致的炎癥反應,本研究結果與其一致。本文平板菌落計數結果顯示,DS組菌落數明顯少于對照組,表明DS在體內可發揮抗真菌作用,抑制AF的生長。

綜上所述,DS通過抗真菌和抗炎作用改善AF性角膜炎。其可能機制為:①DS通過破壞菌絲結構、減少真菌負荷抑制AF的生長,減弱AF的毒力作用;②DS通過增強Nrf2的表達、調控促炎因子水平以及抑制炎癥細胞浸潤起到抗炎作用。